miR-26a 在糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合中的作用

俞楠澤 龍 笑 白 明 王曉軍

創(chuàng)面愈合具有非常復雜調控機制，許多內源性或外源性的因素均可影響其生物學過程，其中糖尿病是最為常見的不利因素。約15%的糖尿病患者會產生糖尿病性潰瘍創(chuàng)面，其中84%的患者會經歷截肢［1］。促進血管化，增加創(chuàng)面血供是治療糖尿病創(chuàng)面的關鍵之一。小分子RNA(miRs)是一類內源性的、小的、非編碼RNA，在轉錄后水平通過抑制基因表達調節(jié)細胞活動［2］。miR-26a 是新發(fā)現(xiàn)的具有血管生成抑制作用的miR，利用抑制劑阻斷其表達后，心肌梗死模型中血管新生增加兩倍，因此，miR-26a 被認為是缺血性疾病的治療新靶點［3］。但miR -26a 在糖尿病模型中的表達和調控血管新生的作用，尚未見報道。在本研究中，筆者檢測了糖尿病小鼠與非糖尿病小鼠創(chuàng)面組織中miR -26a 的表達差異，并將外源性miR-26a 抑制劑應用于糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，探討其對傷口愈合的影響。

材料與方法

1.實驗材料:清潔級雄性7 ～8 周齡C57/BL6 小鼠6 只，db/db 糖尿病小鼠18 只，均購于Jackson 實驗室。mmu -miR-26a-5p 抑制劑和陰性對照劑(廣州銳博生物科技有限公司)，氯胺酮(美國Phoenix 公司)，甲苯噻嗪(美國AnaSed 公司)，CD31 抗體(美國BD Biosciences 公司)，Tegaderm 透明敷料(美國3M 公司)，mirScript 試劑盒(美國Qiagen 公司)，TRIzol 試劑(美國Invitrogen 公司)，DAB 顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

2.實驗方法:(1)小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型建立和處理:腹腔注射氯胺酮90mg/kg +甲苯噻嗪:9mg/kg 麻醉，電動剃刀和脫毛膏脫去背部所有毛發(fā)。在小鼠背部正中偏尾側制造1cm×1cm 皮膚全層缺損創(chuàng)面，注意徹底去除皮下的肉膜層，直至肌膜淺面，以阻止創(chuàng)面收縮。隨機抽取糖尿病小鼠6 只與C57 小鼠組成糖尿病組和非糖尿病組，3 天后取創(chuàng)面組織行RT-PCR 檢測。將余下12 只糖尿病小鼠隨機分為兩組:miR-26a 抑制劑組和對照組，分別用1ml 注射器25G 針頭均勻注射濃度為50μmol/L 的miR-26a 抑制劑和陰性對照劑，每邊0.1ml。并在創(chuàng)面基底注射0.1ml 的相應試劑。所用動物模型作相應處理后用Tegaderm 透明敷料覆蓋創(chuàng)面。術后單籠飼養(yǎng)。(2)RT-PCR:糖尿病組和非糖尿病組在術后3天處死，取創(chuàng)面皮膚樣本，勻漿，TRIzol 法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質量，紫外分光光度計來測定總RNA 的濃度。用mirScript 試劑盒檢測miR -26a 的表達。以內源性U6 作為內參，ΔΔCT 法計算相對表達量。(3)創(chuàng)面愈合觀察:密切觀察創(chuàng)面愈合情況，miR -26a 抑制劑組和對照組于術后0、3、7、10 天更換敷料，創(chuàng)面拍照的同時用透明薄膜描印創(chuàng)面。Image J 軟件分析創(chuàng)面面積，計算創(chuàng)面愈合的百分率。其計算公式為:創(chuàng)面愈合率(%)=(初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。(4)常規(guī)HE 染色和免疫組化染色:①常規(guī)HE 染色:于創(chuàng)面建立后第10 天取材，標本甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片、脫蠟后行HE 染色觀察創(chuàng)面新生組織中皮膚、肉芽等結構，測量創(chuàng)面肉芽組織的厚度;②CD31 免疫組化染色:石蠟切片經抗原修復和血清封閉后在切片上滴加大鼠抗小鼠抗體，濃度為1∶100，4℃過夜。次日滴加兔抗大鼠二抗，濃度1∶200，DAB 顯色，蘇木素復染，陽性細胞呈棕黃色。中性樹脂封片。結果判定時各組創(chuàng)面隨機選取6 張切片，在高借鏡下數(shù)出每張切片中的所有陽性細胞數(shù)。由3 位有經驗的實驗人員分別計數(shù)，取平均值作統(tǒng)計學分析。

3.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據以均數(shù)±標準差(±s)表示。采用t 檢驗分析組間差異，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.miR-26a 的表達:創(chuàng)面模型建立后3 天，db/db 組miR-26a 表達水平是C57 組的2.02 ±0.02 倍(P ＜0.05)，表明糖尿病小鼠體內的miR -26a 含量明顯高于非糖尿病小鼠(圖1)。對照組miR-26a 表達水平是miR - 26a 抑制劑組的22. 08 ± 0. 10 倍(P ＜0. 01)，表明局部注射miR - 26a 抑制劑后，miR-26a 的表達被明顯抑制(圖2)。

2.創(chuàng)面愈合速度:創(chuàng)面模型建立后第3 天起miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面愈合百分率高于對照組，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。術后10 天，兩組動物創(chuàng)面均有50%以上開放性創(chuàng)面，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖3、圖4)。

圖1 糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠創(chuàng)面組織中miR-26a 的表達水平

圖2 miR-26a 抑制劑組和對照組小鼠創(chuàng)面組織中miR-26a 的表達水平

圖3 不同時間點創(chuàng)面愈合情況

圖4 不同時間點創(chuàng)面愈合百分率比較

3.HE 染色:術后第10 天，miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面內肉芽組織較對照組明顯增厚，細胞層次增多。經測量，miR-26a 抑制劑組創(chuàng)面肉芽組織厚度為對照組的2.3 倍(P ＜0.05，圖5)。

4.免疫組化染色:CD31 主要表達于血管內皮細胞的細胞質，呈棕黃色顆粒狀。miR-26a 抑制劑組和對照組每張切片內的新生血管數(shù)分別為47.8 ±13.2 和30.5±6.6，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，圖6)。

討 論

圖5 術后10 天常規(guī)HE 染色(×100)

圖6 術后10 天CD31 免疫組化染色(×100)

隨著生活水平提高和飲食結構的改變，糖尿病發(fā)病率逐漸上升，臨床中的糖尿病潰瘍創(chuàng)面患者也隨之增多［4］。在正常的創(chuàng)面愈合過程中，新生的和遷移的成纖維細胞、血管內皮細胞和巨噬細胞等形成的肉芽組織構成了創(chuàng)面床。細胞外基質的沉積和成纖維細胞分泌的生長因子促進了血管內皮細胞新生血管并滋養(yǎng)肉芽組織。由血管內皮細胞參與的血管新生過程在整個創(chuàng)面愈合的過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。然而糖尿病引發(fā)微血管基膜增厚，導致炎性細胞黏附在微血管內膜上，創(chuàng)面局部抗感染能力下降。局部血液供應的減少并伴隨著靜脈血管回流功能的下降，使創(chuàng)面局部缺血缺氧，創(chuàng)面愈合進程不能按照有序的生物學步驟進行，繼發(fā)不愈［6，7］。所以，糖尿病創(chuàng)面常常具有創(chuàng)面較深、繼發(fā)感染、肉芽脆弱、反復發(fā)作、長期不愈等特征。因此，探索糖尿病難治性創(chuàng)面的機制并尋找積極而合理的治療方法一直是研究的熱點和難點。

Jackson 實驗室在C57/BL6 小鼠上發(fā)現(xiàn)糖尿病是位于4 號染色體的瘦素受體基因突變所致，并在此基礎上建造的db/db 糖尿病小鼠是現(xiàn)今最成熟的糖尿病小鼠模型。db/db 小鼠主要表現(xiàn)為下丘腦缺陷，對瘦素缺乏反應，不能產生飽感，導致合成代謝大于分解代謝，脂肪堆積，最終發(fā)展為嚴重的糖尿病伴有明顯的高糖血癥。此模型具有和人類2 型糖尿病患者類似的臨床癥狀:多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗、脂質代謝異常等［8］。

miR 在轉錄后水平通過結合30 非翻譯區(qū)(UTR)互補的區(qū)域調節(jié)基因的表達，稱為mRNA 翻譯抑制或mRNA 降解［9］。miR-26a 是新發(fā)現(xiàn)的具有血管生成抑制作用的miR，常作為腫瘤抑制基因存在。PTEN 是miR -26a 的直接目標，其通過抑制PTEN的表達進而負調節(jié)PI3K/Akt 信號通路，抑制HIF -1α 穩(wěn)定，而HIF-1α 可調節(jié)多種靶向因子，如血管內皮生長因子(VEGF)，紅細胞生長因子等表達，促進血管新生［10，11］。此外，PTEN 還控制Jun N -末端激酶(JNK)的活性，有效地促進VEGF 的表達，促進血管生成相關的細胞生長以及生存因子表達增加，刺激血管的形成［12，13］。最近研究發(fā)現(xiàn)，在人類及動物心肌梗死模型中，利用miR -26a 抑制劑阻斷其表達后，在兩天內即可迅速誘導強有力的血管生成，新生血管數(shù)量增加兩倍，梗死面積顯著減少［3］。在肝癌細胞中，miR-26a 通過PI3K/Akt/HIF-1α/VEGFA 通路調節(jié)其血管生成［14］。但miR-26a 在創(chuàng)面愈合中的作用及其在糖尿病模型中的表達，尚未見相關報道。

本研究通過構建2 型糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，局部應用miR -26a 抑制劑后，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面內毛細血管的生成增多，創(chuàng)面灌注提高，肉芽組織增生明顯。創(chuàng)面在前3 天后愈合速度相對減慢可能與抑制劑的穩(wěn)定性和作用時效有關。miR-26a 抑制劑可能通過PTEN 相關的信號通路作用于創(chuàng)面組織，但其具體機制仍需進一步研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-26a 在糖尿病小鼠模型中表達升高，抑制miR-26a對創(chuàng)面愈合有一定的促進作用，推測其可作為糖尿病創(chuàng)面治療新的研究靶點。

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