韓俊嶺 孔曉君 李建遠
熱應(yīng)激反應(yīng)是指生物在高溫環(huán)境下發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)。熱應(yīng)激能引起機體產(chǎn)生活性氧,導(dǎo)致氧化損傷,改變胞內(nèi)的信號傳遞,該過程中生物體能夠選擇性合成一組多肽:熱休克蛋白(HSPs)[1]。根據(jù)分子質(zhì)量和等電點分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 等家族[2]。其中HSP90 是HSPs 中高度保守的胞質(zhì)蛋白,也是重要的成員,其中又以亞型HSP90α 研究最為廣泛,且HSP90α 主要存在于大腦和睪丸中[3]。因此,了解陰囊熱應(yīng)激后機體生殖系統(tǒng)中HSP90α 的表達及機體抗氧化能力的改變具有重要意義。本實驗通過建立陰囊熱應(yīng)激模型,探討熱應(yīng)激后小鼠生殖系統(tǒng)HSP90 的表達規(guī)律及小鼠抗氧化能力的改變。
1.實驗動物及試劑:實驗所用雄性小鼠40 只,8 周齡,體重40 ~45g,SPF 級,由濱州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。SOD、MDA 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。實驗中所用其他化學(xué)試劑均為分析純。分光光度計為英國柏楉Biowave Ⅱ紫外可見分光光度計(Biochrom WPA Biowave Ⅱ),圖像分析采用德國共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM-510 META)分析儀,全自動精子分析儀采用美國漢密爾頓(IVOS-CASA)系統(tǒng)。
2.實驗方法:(1)實驗設(shè)計:將56 只小鼠隨機分為正常對照組和熱應(yīng)激組。各組熱應(yīng)激后再按0、1、4、12、24、48h 隨機分成7 個亞組,每組10 只小鼠。試驗組小鼠在飼養(yǎng)7 天后進行熱應(yīng)激處理。熱應(yīng)激模型參照Cai 等[4]的研究方法:熱應(yīng)激組小鼠予5%水合氯醛(0.7ml/100g)麻醉后,將小鼠身體的下1/3 部分(包括陰囊、后腿、尾巴)浸于43℃恒溫水中30min,擦干后回籠。對照組浸于22℃恒溫水中30min。各亞組小鼠分別于熱應(yīng)激后0、1、4、12、24、48h 采用摘除眼球法取血,并分離血清檢測血清中的SOD。待血液流盡后予頸椎脫臼處死,取左側(cè)睪丸、附睪及肝臟稱重,用于計算臟器系數(shù),之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24h,常規(guī)石蠟包埋、切片(5μm),用于組織學(xué)研究。右側(cè)睪丸取一部分組織提取RNA,用作PCR 檢測。右側(cè)附睪用于制備精子懸液,計算精子活力、存活率及畸形率。(2)檢測項目:①睪丸結(jié)構(gòu)變化檢測,通過熒光TUNEL 實驗檢測熱應(yīng)激后睪丸的細胞凋亡情況;②睪丸、附睪質(zhì)量指數(shù),睪丸、附睪質(zhì)量系數(shù)公式為:質(zhì)量指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g);③精子活力、活率、畸形率檢測,取出右側(cè)附睪,置于適量37℃的PBS 中,用眼科剪剪碎,制成精子懸液。滴1 滴懸液于干凈的玻片上,用全自動精子分析儀檢測相關(guān)指標。評估精子的活力等級,將其分為3 級(快速前向運動;非前向運動精子;不運動精子)。累計檢測400 個精子,計算精子活力。精子活力(%)=(前向運動+非前向運動)/精子總數(shù)×100%。取上述懸液滴加于玻片上,加等量的1%的伊紅染液混勻,加蓋玻片靜置30s,用相差顯微鏡計數(shù)400個精子,計算精子存活率。將懸液涂片,干燥后用甲醇固定5min,用HE 染色。計數(shù)400 個精子并檢查精子形態(tài),計數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子;④睪丸、附睪中HSP90α 基因的RT-PCR 檢測,提取睪丸和附睪中RNA,反轉(zhuǎn)錄后對HSP90α 基因和β-actin 進行PCR 擴增。取PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行光密度分析;⑤清SOD、MDA 檢測,按照試劑盒操作說明測定對照組和應(yīng)激后0、4、24、48h 組小鼠血液中SOD、MDA 含量,分析小鼠抗氧化能力的改變。
圖1 熱應(yīng)激后睪丸細胞凋亡的情況(×400)
3.統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS 13.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析,采用單向方差分析,計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示,P <0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.熱應(yīng)激對睪丸細胞的影響:由結(jié)果可知,熱應(yīng)激后會造成小鼠睪丸細胞的凋亡,且主要集中在精原細胞和初級精母細胞,同時睪丸中其他細胞的凋亡也增加,并且細胞的凋亡程度在12h 時最為嚴重,48h時基本恢復(fù)正常(圖1)。
2.陰囊熱應(yīng)激對小鼠臟器指數(shù)的影響:各組小鼠的睪丸、附睪的重量及質(zhì)量指數(shù)結(jié)果見表1。隨著應(yīng)激時間的延長,其中各個時間點睪丸指數(shù)、肝臟指數(shù)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P >0.05)。0、1h 組的附睪指數(shù)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。
表1 陰囊熱應(yīng)激后小鼠臟器指數(shù)的變化(±s)
表1 陰囊熱應(yīng)激后小鼠臟器指數(shù)的變化(±s)
與對照組比較,* P <0.05
組別 n 睪丸指數(shù) 附睪指數(shù) 肝臟指數(shù)對照組10 0.802 ±0.021 0.216 ±0.011 51.43 ±7.11 0h 組 10 0.699 ±0.055 0.114 ±0.008* 45.32 ±5.03 1h 組 10 0.687 ±0.048 0.140 ±0.004* 45.73 ±6.16 4h 組 10 0.746 ±0.065 0.147 ±0.003 46.12 ±7.25 24h 組10 0.768 ±0.130 0.176 ±0.015 47.33 ±4.12
3.陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響:陰囊熱應(yīng)激后,小鼠精子活力、存活率及正常精子率都有不同程度的下降,其中0h 組精子活力明顯低于對照組(P <0.05),而存活率48h 內(nèi)下降趨勢不顯著,與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。隨著時間的延長,精子畸形率在12h 和24h 時最高,明顯高于對照組(P <0.05),到48h 時基本恢復(fù)正常,結(jié)果見表2。
表2 陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響(±s,%)
表2 陰囊熱應(yīng)激對精子活力、存活率及形態(tài)的影響(±s,%)
與對照組比較,* P <0.05,**P <0.01
組別 n 精子活力 存活率 畸形率對照組6 84.13 ±3.12 86.82 ±5.86 8.04 ±0.53 0h 組 6 70.41 ±4.09* 80.11 ±5.56 9.21 ±0.75 12h 組 6 74.07 ±4.01 82.76 ±3.29 14.33 ±1.03**24h 組 6 75.71 ±3.68 84.17 ±3.75 12.26 ±0.14*48h 組6 77.43 ±2.47 83.98 ±4.72 9.41 ±0.21
4.急性熱應(yīng)激對小鼠睪丸、附睪中HSP90α 表達的影響:在正常情況下,睪丸、附睪組織中HSP90α 的表達量較低。急性熱應(yīng)激處理后,睪丸中HSP90α 的表達水平開始升高,在4h 達到高峰(圖2A)。0、1、4、12h 組均顯著高于對照組(P <0.05),隨著時間的延長HSP90α 表達量逐漸恢復(fù),24、48h 組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05,圖2B)。HSP90α 在附睪中的表達在0、1、4、12、24h 組均顯著高于對照組(P<0.05),48h 組表達水平仍高于正常水平,但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05,圖3)。
圖2 熱應(yīng)激后HSP90α 在睪丸中的表達
圖3 熱應(yīng)激后HSP90α 在附睪中的表達
5.陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響:熱應(yīng)激處理后,小鼠血清中SOD 水平明顯升高,其中0、4h 組顯著高于對照組(P <0.05),而24、48h 組基本恢復(fù)正常。血清中MDA 含量在熱應(yīng)激處理后4h 顯著增加,明顯高于對照組(P <0.05),24h 組有所下降,與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05,表3)。
哺乳動物的睪丸和附睪的溫度比身體核心溫度低,精子發(fā)生過程在睪丸內(nèi)進行,只有睪丸保持較低的溫度才能保證生精小管內(nèi)精子的正常產(chǎn)生[5]。哺乳類動物睪丸位于體外的陰囊內(nèi),對溫度的變化非常敏感,并且陰囊對溫度有特殊的調(diào)節(jié)能力,可以使睪丸內(nèi)保持適宜溫度,有利于精子的發(fā)生。如果陰囊溫度升高至一定程度,睪丸溫度會隨之升高而超出最適溫度范圍,致使睪丸組織正常的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,引起生精細胞凋亡,最終導(dǎo)致睪丸的生精功能受到損害,精子畸形率升高、活力下降,而且性腺激素分泌量及成分發(fā)生改變,嚴重時可能導(dǎo)致雄性不育[6]。當陰囊溫度升高,超過其調(diào)節(jié)能力時,也會對附睪內(nèi)精子的成熟產(chǎn)生影響,導(dǎo)致精子相關(guān)指標下降。熱休克蛋白普遍存在于原核和真核生物體內(nèi),高溫、寒冷、低氧、創(chuàng)傷等均可引起熱休克蛋白的高表達,其中HSP90 可通過維持信號分子蛋白的穩(wěn)定性,參與細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生理過程,從而協(xié)助機體對抗不良環(huán)境[7]。
表3 陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)
表3 陰囊熱應(yīng)激對小鼠血清抗氧化能力的影響(±s)
與對照組比較,* P <0.05,**P <0.01
組別 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)對照組10 199.13 ±23.62 8.02 ±0.87 0h 組 10 253.41 ±34.09** 8.41 ±0.53 4h 組 10 219.47 ±27.01* 9.72 ±0.49*24h 組 10 205.73 ±23.18 7.98 ±0.45 48h 組10 197.43 ±21.47 8.08 ±0.62
本實驗結(jié)果顯示,在陰囊熱應(yīng)激后,睪丸細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象,該結(jié)果和相關(guān)的研究結(jié)果相似[8]。一般認為認為凋亡途徑包括:內(nèi)源性途徑(也稱線粒體途徑)和外源性途徑(也稱死亡受體途徑)。Absalan 等[6]研究發(fā)現(xiàn),睪丸溫度升高能夠引起多種細胞凋亡相關(guān)因子的改變,如Bax、Bcl -2、P53、survivin-140 等,故推斷陰囊熱應(yīng)激時通過兩種凋亡途徑引起睪丸細胞損傷。
熱應(yīng)激后不同時間點的試驗組小鼠睪丸指數(shù)均有所下降,但與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但相對于睪丸指數(shù)的變化不顯著,附睪指數(shù)則顯著增加,該結(jié)果和曹文等[9]的研究結(jié)果一致。睪丸、附睪質(zhì)量指數(shù)變化的趨勢不同,該結(jié)果可能與他們的組織結(jié)構(gòu)、生理功能不同相關(guān),具體原因和機制需要進一步研究。此外陰囊熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠精子的活力明顯下降、畸形率顯著升高,引人注意的是12h 組精子的畸形率最高,其原因和機制有待進一步分析和研究。李德軍等[10]的研究進一步表明,熱應(yīng)激能夠降低小鼠的精子數(shù),并損傷小鼠的精子。以上結(jié)果說明43℃的陰囊應(yīng)激條件已經(jīng)超出了其對溫度的調(diào)節(jié)能力,并對生殖系統(tǒng)造成損傷。
HSP90α 是胞內(nèi)蛋白,與熱應(yīng)急和氧化損傷密切相關(guān),由于其作用底物與多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān),且可以作為分子伴侶發(fā)揮作用,其生理作用越發(fā)引起人們的關(guān)注,但在生殖系統(tǒng)中的研究較少[11]。本實驗研究了熱應(yīng)激前、后HSP90α 在睪丸、附睪中的表達情況,PCR 結(jié)果顯示熱應(yīng)激前HSP90α 在睪丸中有表達,但相對較弱。熱應(yīng)激后表達量明顯增強,且有時間性。提示在陰囊熱應(yīng)激過程中,在不同的時間點HSP90α 發(fā)揮著對生殖系統(tǒng)的保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)陰囊熱應(yīng)激時,在睪丸和附睪中HSP90α 高表達的同時血清中SOD 明顯升高,MDA 也有所升高,提示機體整體的抗氧化能提高,具體機制需要做進一步研究。
綜上所述,陰囊熱應(yīng)激對雄性小鼠的生殖系統(tǒng)造成了損傷。PCR 結(jié)果表明HSP90α 可能參與睪丸中精子的發(fā)生與附睪內(nèi)精子的成熟,然而目前為止,對于HSP90α 在雄性生殖系統(tǒng)中的作用的認識非常有限。這些方面需要人們做進一步的研究,以便更深入地了解雄性生殖和雄性不育。
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