糖痛方對糖尿病大鼠肢體缺血再灌注后肝腎ICAM-1 和MPO 表達(dá)的影響

黃 達(dá) 李鳴鏑 鄭亞琳 王秋虹 林 蘭

肢體缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury of limb，IRIL)是臨床上常見的病理生理過程，斷肢再植、肢體主要供血?jiǎng)用}修補(bǔ)術(shù)、下肢血栓再通術(shù)以及骨外科長時(shí)間使用止血帶等均可以引起IRIL。研究表明，IRIL 不僅可以引起肢體遠(yuǎn)端組織嚴(yán)重?fù)p傷，而且可以導(dǎo)致遠(yuǎn)隔臟器功能障礙，甚至出現(xiàn)多臟器衰竭，其中肝、腎是最常見的兩個(gè)受損器官［1，2］。由于糖尿病患者體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)并且常合并周圍血管病變等并發(fā)癥，因此與非糖尿病患者相比，臨床上糖尿病患者更容易發(fā)生IRIL 并且損傷程度也更為嚴(yán)重［3］。目前IRIL 的實(shí)驗(yàn)研究主要針對正常大鼠，對糖尿病大鼠的研究很少，本實(shí)驗(yàn)在糖尿病大鼠肢體缺血再灌注模型的基礎(chǔ)上采用糖痛方治療，并設(shè)立模型組和正常對照組，通過檢測各組大鼠血漿、肝、腎ICAM-1 和MPO 的表達(dá)水平，探討肢體缺血再灌注后糖尿病大鼠肝腎損傷的作用機(jī)制以及糖痛方的保護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性SD 大鼠70 只，體重180 ±20g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物房。(2)實(shí)驗(yàn)藥物:糖痛方:由黃芪、桂枝、白芍、川芎、細(xì)辛、姜黃、土鱉蟲組成。每30 付中藥熬成1000ml 液體(A 液)，A 液使用純凈水稀釋1 倍為B液，B 液稀釋1 倍為C 液。(3)主要試劑和設(shè)備:鏈脲佐菌素(Sigma 公司)，精蛋白鋅胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，Rat sICAM -1/CD54 ELISA 試劑盒(R＆D Systems 公司)，MPO 試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ICAM-1(G-5)(Santa 公司)，MPO(M-17)(Santa 公司)，7160 全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)，STAT FAX 2100 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Awareness Technology 公司)，小鼠/山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

2.模型制備:(1)糖尿病模型制備:從70 只SD 大鼠中隨機(jī)選擇12 只作為正常對照組，剩余58 只大鼠禁食不禁水12h，使用pH 4.2 的檸檬酸鹽緩沖液配制濃度為2%的鏈脲菌素(STZ)溶液，按60mg/kg 的劑量腹腔注射，72h 后測定大鼠尾尖血糖，以隨機(jī)血糖持續(xù)＞16.7mmol/L 作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。造模期間，1 只大鼠死亡，4 只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)，對于血糖＞27mmol/L 的大鼠予精蛋白鋅胰島素1 ～2IU，每天1 次皮下注射，以排除血糖因素影響并降低大鼠死亡率。(2)下肢缺血再灌注模型制備［4，5］:糖尿病大鼠飼養(yǎng)1 個(gè)月后，使用3%戊巴比妥鈉麻醉，沿腹壁正中線切開長約3cm 切口，鈍性剝離腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈和右側(cè)髂總動(dòng)脈;另沿右側(cè)腹股溝韌帶剪開長約2cm 切口，鈍性剝離股動(dòng)脈，使用動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈，計(jì)時(shí)3h 后打開動(dòng)脈夾恢復(fù)下肢血供，逐層縫合肌肉、皮膚，使用青霉素抗感染。手術(shù)過程及術(shù)后7 天死亡11 只大鼠，42 只造模成功。

3.分組給藥:術(shù)后7 天，待傷口基本愈合后開始分組灌胃給藥。模型大鼠42 只，隨機(jī)分為4 組:模型組(n =10)、糖痛方小劑量組(n=10)、糖痛方中劑量組(n=11)和糖痛方大劑量組(n=11)。糖痛方小、中、大劑量組按0.78ml/(100g·d)分別灌服C 液、B 液、A 液(分別相當(dāng)于成人劑量的3.5、7.0及14.0 倍)，模型組和正常對照組(n =12)按0.78ml/(100g·d)灌服純凈水。灌胃8 周，期間死亡2 只大鼠。

4.指標(biāo)檢測:灌胃8 周后，使用3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血(2 只取血失敗，3 只出現(xiàn)溶血，47 只取血成功)，3000r/min 離心15min 分離血漿，采用Elisa 法檢測血漿sICAM-1 水平，比色法檢測血漿MPO 水平。然后截取肝臟、腎臟部分組織，放入10%甲醛磷酸鹽溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制作石蠟切片;采用二步法免疫組化染色，操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，200 倍顯微鏡下拍照。

結(jié) 果

1. 血漿sICAM -1 和MPO 水平:與正常對照組比較，模型組大鼠血漿sICAM -1 和MPO 水平明顯升高(P ＜0.01)。經(jīng)糖痛方治療后大鼠血漿sICAM-1 和MPO 水平下降，其中與模型組比較，糖痛方中、大劑量組sICAM-1 水平明顯下降(P ＜0.01)，糖痛方小、中、大劑量組MPO 水平明顯下降(P ＜0.01)。與糖痛方小劑量組比較，糖痛方大劑量組sICAM-1 和MPO 水平明顯下降(P ＜0.01，表1)。

表1 各組大鼠血漿sICAM-1 和MPO 的表達(dá)水平(±s)

表1 各組大鼠血漿sICAM-1 和MPO 的表達(dá)水平(±s)

與正常對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01;與糖痛方小劑量組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與糖痛方中劑量組比較，☆P ＜0.05

組別 n sICAM-1(pg/ml) MPO(U/L)11 2629.07±670.66 25.94±5.04模型組 9 7594.11±1578.70＊＊ 61.24±9.79＊＊糖痛方小劑量組 10 6062.96±1067.41＊＊ 48.77±5.06＊＊#糖痛方中劑量組 7 4788.98±617.56＊＊# 40.05±9.21＊＊#△糖痛方大劑量組 10 3700.29±607.89* #△△☆ 37.98±7.86＊＊#△△正常對照組

2.肝臟ICAM-1 和MPO 的表達(dá):模型組大鼠肝臟ICAM-1 表達(dá)水平明顯升高，主要表達(dá)于肝小葉中央靜脈和肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞表面，經(jīng)糖痛方小、中、大劑量治療后肝臟ICAM -1 表達(dá)水平逐漸下降，正常大鼠肝臟表達(dá)少量ICAM-1(圖1)。模型組MPO 表達(dá)水平升高，主要表達(dá)于中央靜脈周邊的肝細(xì)胞，經(jīng)糖痛方治療后肝臟MPO 表達(dá)水平有所下降，正常大鼠肝臟基本不表達(dá)MPO(圖2)。

圖1 各組大鼠肝臟免疫組化ICAM-1 表達(dá)(×200)

3.腎臟ICAM-1 和MPO 的表達(dá):模型組大鼠腎臟ICAM-1 表達(dá)水平明顯升高，主要表達(dá)于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)糖痛方小、中、大劑量治療后腎臟ICAM -1 表達(dá)水平逐漸下降，正常大鼠腎臟表達(dá)少量ICAM-1(圖3)。模型組腎臟MPO 表達(dá)水平明顯升高，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)糖痛方小、中、大劑量治療后腎臟MPO 表達(dá)水平逐漸下降，正常大鼠腎臟表達(dá)少量MPO(圖4)。

圖2 各組大鼠肝臟免疫組化MPO 表達(dá)(×200)

圖3 各組大鼠腎臟免疫組化ICAM-1 表達(dá)(×200)

圖4 各組大鼠腎臟免疫組化MPO 表達(dá)(×200)

討 論

肢體缺血再灌注損傷(IRIL)是指各種原因引起的肢體缺血在血流恢復(fù)后機(jī)體組織器官損傷加重的病理生理過程，IRIL 不僅可以導(dǎo)致肢體局部缺血組織損傷加重，而且可以引起遠(yuǎn)隔器官損傷，其中肝、腎是臨床上常見的兩個(gè)受損器官。IRIL 形成的主要機(jī)制包括氧自由基損傷、炎癥和微循環(huán)障礙等［6］。安英等［1］發(fā)現(xiàn)IRIL 可以導(dǎo)致大鼠肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞變性、壞死。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性升高和丙二醛(MDA)下降。廉穩(wěn)等［2］發(fā)現(xiàn)IRIL 可以導(dǎo)致大鼠腎小球充血、水腫。血漿肌酐、尿素氮、黃嘌呤氧化酶(XOD)、MDA 升高，SOD 下降。以上研究表明肢體再灌注對肝、腎的損傷機(jī)制與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選擇ICAM-1 和MPO 兩項(xiàng)指標(biāo)在于進(jìn)一步探討肢體缺血再灌注后糖尿病大鼠肝、腎的損傷機(jī)制以及糖痛方的保護(hù)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠血漿、肝、腎中ICAM-1 和MPO 表達(dá)水平升高，經(jīng)糖痛方小、中、大劑量治療后，ICAM -1 和MPO 表達(dá)水平逐漸下降。ICAM-1 是免疫球蛋白超家族成員之一，主要介導(dǎo)炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附反應(yīng)。靜息狀態(tài)下，ICAM-1 在血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞上呈低水平表達(dá)。炎癥狀態(tài)下，ICAM -1 的表達(dá)水平迅速上調(diào)［7］。MPO 是含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，其主要功能是催化生成氧自由基，可以反應(yīng)組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝腎組織ICAM-1 和MPO 表達(dá)明顯增高，說明肢體缺血再管注后糖尿病大鼠肝腎組織存在明顯的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致肝腎組織損傷的重要機(jī)制之一。

糖痛方是由黃芪桂枝五物湯加減變化而成，組成包括黃芪、桂枝、白芍、川芎、細(xì)辛、姜黃、土鱉蟲，主要用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變和下肢血管病變。藥理研究表明方中多位中藥可以通過多種途徑減輕缺血再灌注損傷。其中黃芪可以通過抑制TNF -α、IL-10、caspase -3、Bax mRNA 的表達(dá)水平減輕肝腎缺血再灌注損傷［8，9］。姜黃可以通過降低研究缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和中性粒細(xì)胞浸潤減輕肝腎缺血再灌注損傷［10，11］。川芎內(nèi)酯A 可以降低心肌缺血再灌注后心肌乳酸脫氫酶和MDA 的含量，并提高心肌SOD 的活性［12］。川芎揮發(fā)油可以增加腦缺血再灌注模型大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、SOD 含量，并降低MDA 表達(dá)水平［13］。土鱉蟲能增強(qiáng)缺血再灌注后腦組織中SOD和谷胱甘肽(GSH)含量并降低MDA 的含量［14］。白芍總苷可以通過提高GRP78 的表達(dá)水平減輕心肌缺血再灌注損傷［15］。桂枝蒸餾液可以通過降低心肌脂質(zhì)過氧化物生成并提高SOD 活力減輕離體灌流鼠心缺血再灌注損傷。TNF-α、IL-10、ICAM-1 等指標(biāo)主要反映炎癥狀態(tài)，GSH -Px、NOS、SOD、MPO、MDA等指標(biāo)主要反映氧化應(yīng)激狀態(tài)，caspase -3、Bax mRNA 等指標(biāo)主要反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)。本結(jié)果表明，糖痛方可以通過降低肢體缺血再灌注后糖尿病大鼠血漿、肝、腎組織ICAM -1 和MPO 的表達(dá)水平減輕肝腎組織損傷。結(jié)合以往研究結(jié)果，其保護(hù)作用機(jī)制與降低肝腎組織氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

1 安英，楊寧江，李強(qiáng)，等. 燈盞花素預(yù)適應(yīng)對大鼠肢體缺血再灌注肝損傷的保護(hù)作用［J］. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(4):543 -545

2 廉穩(wěn)，門秀麗，趙利軍，等. 缺血后處理對大鼠肢體缺血再灌注后腎組織的保護(hù)作用［J］. 中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11(19):1 -3

3 任春久，張瑤，崔為正，等. 氧化應(yīng)激在2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展［J］. 生理學(xué)報(bào)，2013，65(6):664 -673

4 Alipour M，Gholami MR，Jafari AI，et al. Intraperitoneal aminoguanidine improves sciatic nerve ischemia-reperfusion injury in male sprague-dawley rats［J］. Cell Mol Neurobiol，2011，31(5):765 -773

5 Wang Y，Schmeichel AM，Iida H，et al. Ischemia-reperfusion injury causes oxidative stress and apoptosis of Schwann cell in acute and chronic experimental diabetic neuropathy［J］. Antioxid Redox Signal，2005，7(11 -12):1513 -1520

6 冷梅，李紅，王晉軍，等. 肢體缺血再灌注損傷的防治［J］. 光明中醫(yī)，2013，28(6):1218 -1219

7 林慶賓，張俐. CAM -1 在脊髓缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)展［J］. 中國中醫(yī)骨傷科雜志，2009，17(12):68 -70

8 陳宜方，桂定坤，陳建國，等. 黃芪水煎劑對腎缺血再灌注損傷大鼠腎小管細(xì)胞凋亡的影響［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(6):1293 -1295

9 殷濤，畢旭東，龐世剛，等. 黃芪對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響［J］. 中國老年學(xué)雜志，2011，31(8):1368 -1371

10 陳晚平，楊盡暉，李珂，等. 姜黃素對肝缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究［J］. 中國普通外科雜志，2010，19(1):37 -40

11 年建華，陸逸庭，黃華平，等. 姜黃素對大鼠腎缺血再灌注損傷及HIF -1α 表達(dá)的影響［J］. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22(12):943 -945

12 高偉，肖永慶. 川芎內(nèi)酯A 預(yù)處理對大鼠離體心臟缺血再灌注所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］. 中國中藥雜志，2005，30(18):1448 -1451

13 盛艷梅，孟憲麗，李春雨，等. 川芎揮發(fā)油對大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞體外存活及腦缺血再灌注損傷的影響［J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012，23(3):536 -538

14 賀衛(wèi)和，曾嶸，成細(xì)華. 土鱉蟲提取液對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］. 中藥藥理與臨床，2008，24(4):43 -44

15 郭道華，韋穎梅，王小靜，等. 白芍總苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用及對GRP78 表達(dá)的影響［J］. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8(5):556 -558