過表達mimecan 對人臍靜脈內皮細胞增殖和凋亡的作用初探

王 晶 沈瓊娜 張惠潔 胡小磊 陳鳳玲

骨生成誘導因子(osteoinductive factor，OIF)，又名mimecan 或osteoglycin，最早從牛的骨基質中提取出來的一種分泌蛋白［1，2］。Mimecan 屬于亮氨酸富集蛋白家族成員，在不同物種間該基因的結構高度保守［3］。Mimecan 在人體卵巢、肺、角膜、腎上腺、食管、心臟等組織中廣泛表達，在調控膠原纖維形成及腫瘤細胞的增殖和遷移方面發(fā)揮了重要作用［4，5］。研究發(fā)現(xiàn)mimecan 與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)密切相關。Kampmann 等［6］發(fā)現(xiàn)在新生血管中mimecan 表達量下調，提示mimecan 可能與血管重塑相關。Kwon等［7］應用免疫組化染色技術發(fā)現(xiàn)，mimecan 在動脈硬化斑塊鈣化區(qū)的表達量升高。Borja 等［8］發(fā)現(xiàn)在發(fā)生AS 的血管中，mimecan 在血管中層表達下降，在激活的內皮和新生內膜中表達量上調。這些提示mimecan可能在AS 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本實驗在體外應用反轉錄病毒載體構建了穩(wěn)定過表達mimecan 的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)模型，并且初步觀察過表達mimecan 后HUVEC 增殖和凋亡的變化，為進一步探索mimecan 與AS 的關系奠定基礎。

材料與方法

1.材料與試劑:pmscv -puromycin -IRES -GFP (pMSCV PIG)、VSV -G、gag -pol (Clontech 公司);限制性內切酶BglⅡ和XhoⅠ試劑盒(TaKaRa 公司);質粒小抽提試劑盒(Axygen 公司);中抽試劑盒(MN 公司);293T 人胚腎細胞株(293T 細胞)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(ATCC 公司);脂質體Lipo-fectamine 2000、Trizol (Invitrogen 公司);反轉錄和realtime PCR 試劑盒(Promega 公司)，細胞培養(yǎng)基DMEM、opti- MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、嘌呤霉素(puromycin)(Gbico 公司);兔抗人FLAG 單抗(Sigma 公司)，兔抗人GAPDH 單抗、HRP 標記山羊抗兔二抗(Cell signal);Western blot化學發(fā)光試劑盒(Pierce 公司)。

2.HUVEC 及293T 細胞培養(yǎng):HUVEC 及293T 細胞均以添加10%FBS 的DMEM 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基置于37℃、含5%CO2的細胞孵育箱中，細胞傳代比例1∶6，每2 ～3 天傳代1 次。

3.pMSCV PIG-OIF-3FLAG 反轉錄病毒載體的構建及鑒定:人mimecan 基因全長序列以含人mimecan 基因編碼序列框架的質粒為模板，經(jīng)PCR 技術擴增，并分別添加了含3 個重復的FLAG 編碼序列和BglⅡ、XhoⅠ的酶切位點。RCP 引物序列分別為 h - mimecan FOR:5' - ACTGAGATCTATGAAGACTCTGCAGTCTACACTTCTCCTGTTACTGCTTGTGCCTCTGATAAAGCCAGCACCACCAACCCAGCAGGACTCACGC - 3'(下劃線為Bgl Ⅱ酶切位點);h - mimecan REV:5' - CTGGCTCGAGTTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGATGTCATGGTCTTTGTAGTCTCCGTCA-TGGTCTTTGTAGTCAAAGTATGACCCTAT-3'(下劃線分別為XhoⅠ酶切位點及3 個FLAG 編碼序列)。將擴增的OIF-3FLAG 片段序列定向克隆到pGEMT Easy 載體中，構建pGEM -T Easy -mimecan -3FLAG 重組載體，并經(jīng)雙酶切及測序鑒定。鑒定成功后，將pGEM - T Easy-mimecan-3FLAG 重組載體經(jīng)BglⅡ、XhoⅠ雙酶切，收集目的片段，經(jīng)T4 連接酶作用，與酶切后的pMSCV PIG 載體連接為pMSCV PIG-OIF-3FLAG 重組載體，經(jīng)轉化、挑克隆、抽質粒，最后測序鑒定。

4.反轉錄病毒的包裝:待處于對數(shù)期生長的293T 細胞融合度達60%時應用脂質體Lipofectamine 2000 進行轉染。將鑒定成功的重組載體pMSCV PIG -OIF -3FLAG(或空載體pMSCV PIG)及包裝載體GAG -POL，VSVG 按質量比3∶3∶2加入無血清的opti-MEM 培液中稀釋，同時按操作說明將適量體積的Lipofectamine 2000 加入opti -MEM 培養(yǎng)基中，室溫孵育5min 后，將質粒溶液與脂質體溶液混合，室溫靜置25min后將混合物加入無血清及雙抗的細胞培養(yǎng)基中，置于孵育箱中孵育6h 后換回常規(guī)培養(yǎng)基，48h 后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達。以空載體轉染作為對照。

5.穩(wěn)定細胞株的構建及篩選:病毒載體轉染293T 細胞48h 后收集細胞培養(yǎng)基的上清液，用孔徑0.45μm 的濾頭過濾上清并加入1，5 -二甲基-1，5 -二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)至終濃度為8μg/ml 混勻，將其加入HUVEC 的培養(yǎng)基中感染目的細胞;8h 后換回常規(guī)培養(yǎng)液，48h 后添加嘌呤霉素至終濃度為1.5μg/ml 進行篩選，4 天后篩選出穩(wěn)定感染反轉錄病毒空載體PMSCV PIG 的HUVEC 細胞株(以下簡稱對照組HUVEC)及重組載體PMSCV PIG -OIF -3FLAG 的HUVEC 細胞株(以下簡稱過表達組HUVEC)。

6.Real-Time PCR 檢測mimecan mRNA 水平表達:待狀態(tài)良好的對照組HUVEC 及過表達組HUVEC 細胞密度達80% ～90%，加Trizol 抽提細胞RNA，1μg 細胞RNA 總量進行反轉錄，得到cDNA。PCR 引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物序列為:GAPDH:上游引物序列5' -gatcatcagcaatgcctcctgc-3'，下游引物序列5' -ggtcatg agtccttccacgatacc-3'。Mimecan:上游引物序列5' -tacttggaccataatgccctgg -3'，下游引物序列5' -aactggtgtcattagccttgc -3'。按照試劑盒操作說明進行cDNA 擴增，20μl 反應體系中含有cDNA 模板4μl，上下游引物各0. 4μl，參比染料CXR 0. 2μl，qPCR Mix 10μl，DEPC 水5μl。以GAPDH 為內參校正每個樣本的循環(huán)閾值(CT)得到ΔCT，根據(jù)公式計算2-ΔΔCT。實驗重復3 次。

7.Western blot 法檢測標簽蛋白FLAG 表達:待對照組HUVEC 及過表達組HUVEC 細胞密度增至90%，加入蛋白裂解液RIPA，按照1∶100 比例加入苯甲基磺酰氟 (PMSF 100mmol/L)，抽提蛋白。應用垂直電泳儀和轉膜儀(Bio -Rad)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜，采用Western blot 化學發(fā)光法檢測FLAG 蛋白的表達量。以GAPDH 為內參。

8.CCK-8 法檢測細胞增殖:分別將處于對數(shù)生長期的過表達組HUVEC 細胞和對照組細胞以2 ×103的細胞密度接種于96 孔 培 養(yǎng) 板 內，每 孔 含 培 養(yǎng) 液100μl，放入培養(yǎng)箱中孵育24h，待細胞密度達60%，每孔加入CCK8 溶液10μl 反應4h 后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450nm 處的光密度值。用無細胞的培液作為空白對照，每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

9.Annexin Ⅴ-PE 染色檢測細胞凋亡:將過表達mimecan的HUVEC 細胞及對照組細胞以5 ×103的細胞密度均勻鋪于48 孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃孵育箱中培養(yǎng)，直至細胞密度達到70% ～80%?？装咫x心，棄上清，然后將每孔的細胞各自轉移至1.5ml EP 管內。向每管中加入195μl Annexin Ⅴ-PE結合液和5μl Annexin Ⅴ-PE 染色液重懸細胞，使其混勻，室溫避光孵育10min。離心，棄上清，加入190μl Annexin Ⅴ-PE結合液。冰浴避光放置。隨即進行熒光觀察，Annexin Ⅴ-PE為紅色熒光。實驗重復3 次。

結 果

1.應用293T 細胞包裝病毒及鑒定:將pMSCV PIG- OIF -3FLAG 重組載體(或pMSCV PIG 空載體)及GAG - POL，VSV - G 共轉染293T 細胞48h后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉染pMSCV PIG - OIF -3FLAG 重組載體及pMSCV PIG 空載體的細胞均有GFP 綠色熒光蛋白表達，表示反轉錄病毒包裝成功(圖1)。

圖1 293T 細胞GFP 熒光觀察(×80)

2.穩(wěn)定過表達mimecan 的HUVEC 細胞株的篩選及鑒定:包裝完成的293T 細胞病毒上清感染HUVEC細胞株48h 后，加嘌呤霉素篩選2 天，熒光顯微鏡下觀察過表達組HUVEC 細胞及對照組HUVEC 細胞均表達GFP (圖2)。real -time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，過表達組mimecan 的mRNA 表達量較對照組細胞株平均高10.3倍，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，圖3)。Western blot 法分析顯示，過表達組細胞株FLAG 蛋白表達陽性，對照組細胞株FLAG 蛋白表達陰性(圖4)。上述結果說明穩(wěn)定過表達mimecan 的HUVEC細胞株構建成功。

圖2 穩(wěn)定細胞株GFP 熒光觀察(×80)

圖3 穩(wěn)定細胞株mimecan mRNA 相對表達水平

圖4 穩(wěn)定細胞株FLAG 標簽蛋白表達量

3. 過表達mimecan 抑制HUVEC 增殖:應用CCK8 法檢測過表達mimecan 后，HUVEC 增殖能力的改變。結果顯示，對照組HUVEC 吸光度平均為1.151，過表達組HUVEC 吸光度平均為1.016，兩組有顯著性差異(P ＜0.05，圖5)，提示過表達mimecan的HUVEC 細胞株增殖能力減弱。

圖5 過表達mimecan 對HUVEC 增殖能力的影響

4.過表達mimecan 促進HUVEC 凋亡:應用AnnexinⅤ- PE 染色觀察過表達mimecan 后，HUVEC凋亡率的改變。結果顯示，過表達組HUVEC 凋亡率平均為4.1%，對照組凋亡率平均為2.1%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，圖6)，提示過表達mimecan的HUVEC 細胞凋亡率增高。

圖6 過表達mimecan 對HUVEC 凋亡的影響(×200)

討 論

mimecan 最早是從牛的骨基質中提取的一種分泌蛋白，人mimecan 基因位于9q22，在不同的組織中廣泛表達，該基因在不同種屬間基因結構高度保守提示其在生物體內重要的生理功能［9，10］。mimecan 與心血管疾病密切相關，在血管的形成，病理生理改變，動脈粥樣硬化、心肌重塑等方面發(fā)揮重要作用。Gu等［2］研究發(fā)現(xiàn)mimecan 在去竇弓神經(jīng)的大鼠模型中參與了大血管的重塑過程。Petretto 等［11］研究發(fā)現(xiàn)大鼠mimecan 表達量與左心室密度呈正相關，提示mimecan 在心肌重塑中可能發(fā)揮了重要作用。Kampmann 等［6］通過建立股動脈結扎的兔子模型，發(fā)現(xiàn)mimecan 在大動脈及新生的側支動脈中主要由外膜的平滑肌細胞及血管周圍的成纖維細胞產(chǎn)生，且在側支動脈的生成過程中表達量下調，這提示mimecan 與大動脈及外周動脈的形成密切相關。Kwon 等［7］應用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，mimecan 在動脈硬化斑塊鈣化區(qū)域表達量升高。Borja 等［8］發(fā)現(xiàn)在AS 損害中，mimecan 在血管中層表達下降，在激活的內皮和新生內膜中表達上調。一些與血管損傷及生成有關的細胞因子，如成纖維細胞生長因子，轉化生長因子β，血小板源性生長因子及血管緊張素Ⅱ可以下調mimecan 的表達［12～14］。這些提示了mimecan 可能成為心血管疾病預防及治療中新的研究方向，但具體的作用機制仍需進一步研究。

AS 發(fā)生的病理生理機制包括血管壁的脂質浸潤、內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖遷移以及黏附分子介導的炎癥等。目前認為血管內皮細胞的損傷是動脈粥樣硬化形成的早期始動環(huán)節(jié)。局部血管內皮細胞更新加快，凋亡增多，內皮細胞增殖和凋亡失衡是AS 發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素，影響了血管內膜的完整性，進而誘發(fā)AS。

本研究應用反轉錄病毒載體pMSCV PIG 構建了穩(wěn)定過表達mimecan 的HUVEC 細胞模型。pMSCV PIG 載體具有嘌呤霉素抗性和表達GFP 的特點，便于穩(wěn)定細胞株的篩選。應用real - time PCR 技術和Western blot 法分別從mRNA 及蛋白表達水平對穩(wěn)定細胞株進行鑒定。應用CCK -8 技術檢測發(fā)現(xiàn)過表達mimecan 后，HUVEC 的增殖能力下降;應用AnnexinⅤ-PE 染色發(fā)現(xiàn)過表達mimecan 后，HUVEC 的凋亡率增多。血管內皮細胞增殖和凋亡的失衡破壞了血管內壁的連貫性，表現(xiàn)為內皮功能紊亂，包括內皮來源的血管收縮及舒張因子釋放改變，誘發(fā)血管痙攣;促使血管平滑肌細胞增殖、遷移至內膜下，促進血小板黏附聚集誘發(fā)血栓形成等。這些因素共同促進了AS 的發(fā)生、發(fā)展。已知影響內皮功能的主要機制，包括內皮信號轉導改變，NO 合酶表達的減少，L-精氨酸利用減少，以及活性氧的增加等。而mimecan 影響內皮細胞增殖和凋亡的機制和途徑尚待進一步研究。

綜上所述，本研究構建了穩(wěn)定過表達mimecan 的HUVEC 細胞模型，初步研究發(fā)現(xiàn)過表達mimecan 抑制HUVEC 增殖，促進細胞凋亡。提示mimecan 通過影響血管內皮細胞的功能進而對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起作用。有利于進一步研究mimecan 在心血管疾病中的作用以及尋找防治心血管疾病的新靶點。

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