靶向EGFR/HER-2 的雙特異性融合蛋白Ec-LDP-Hr 及其烯二炔強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE 的抗結腸癌活性

秦 燁 劉秀均 李 良 劉旭杰 甄永蘇

結腸癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面有一定的進展，其仍是主要的致死性疾?。?］。目前對于靶向腫瘤相關蛋白和阻止腫瘤發(fā)展進程的單克隆抗體及其他生物制品正在進行廣泛研究［2］。聯(lián)合抗體藥物、化療藥以及其他藥物的治療組合可能對結腸癌有更好的療效。

表皮生長因子受體家族屬于跨膜受體酪氨酸激酶家族，其兩大成員，即人表皮生長因子1(human epidermal factor receptor 1，EGFR)和人表皮生長因子2(human epidermal factor receptor 2，HER -2)在結腸癌中有異常高表達［3］。EGFR 和HER -2 在腫瘤中的表達異常增高，可促進腫瘤的生長、增殖、分化和轉移［4］。目前，各種靶向EGFR 的抗腫瘤藥物已經(jīng)用于對轉移性腫瘤的治療［5］。因此，同時靶向EGFR 和HER-2 可能成為治療結腸癌更有效的策略。

筆者曾經(jīng)報道過一種可同時靶向EGFR 和HER-2 的雙特異性強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE，這種融合蛋白是通過基因工程方法在強效抗腫瘤抗生素力達霉素(lidamycin)輔基蛋白的N 端連接一段靶向EGFR 的寡肽(來自配體EGF 的C 環(huán))，以及在C 端連接一段靶向HER - 2 的寡肽片段(來自抗HER-2 抗體C6.5 的VH中CDR3 區(qū)域)［6］。融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 的兩端以靶向肽段作為導向分子，以力達霉素作為“彈頭”藥物，這種利用基因工程融合蛋白靶向腫瘤，不僅可以提高抗腫瘤藥物的特異性，提高療效，還能降低藥物的使用劑量，降低藥物毒性。以往的研究中，筆者主要研究了強化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE 對腫瘤的靶向殺傷作用，在本研究中，筆者更進一步研究未強化的融合蛋白Ec-LDP-Hr 對結腸癌細胞的生長影響，以及聯(lián)合強化融合蛋白對結腸癌移植瘤的抑瘤活性。聯(lián)合靶向融合蛋白及其強化形式融合蛋白的組合有可能成為提高抗腫瘤作用的新策略。

材料與方法

1.菌株、細胞系和實驗動物:BL21(DE3)/pET -Ec -LDP-Hr 表達菌株均由筆者實驗室保存。人結腸癌細胞系HCT-15、HCT -116、HT -29 為本實驗室傳代保存，HCT -15 培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640 的培養(yǎng)液中，HCT-116和HT-29 培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中。本實驗中所用的實驗動物為6 ～8 周齡(18 ～20g)的雌性BALB/c 裸鼠購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。

2.試劑:卡那霉素、IPTG、牛血清白蛋白為Merck 公司產(chǎn)品。MTT、RNASE A、Propidium Iodide (PI)購自Sigma 公司。親和層析柱HisTrap HP (5ml)購自GE 公司。抗體EGFR (D38B1)Rabbit mAb 和HER-2/ErbB2 (29D8)Rabbit mAb 購于CST(Cell Signal Technology)公司。His-Tag(2A8)mouse mAb 購自Abmart公司。二抗均購自北京中杉金橋生物技術公司。Annexin V -FITC 凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。

3.方法

(1)靶向融合蛋白Ec-LDP -Hr 的制備:融合蛋白Ec -LDP-Hr 的制備方法按參考文獻［6］進行，得到的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 和Western blot 法鑒定。

(2)Western blot 法:本實驗中Western blot 法用于細胞蛋白表達水平的檢測。細胞樣品為細胞裂解后的離心得到的上清，用BCA 試劑盒進行蛋白定量，每種細胞裂解樣品按相同上樣量制備。SDS-PAGE 電泳后轉膜，將蛋白轉移至PVDF膜上。經(jīng)牛奶封閉后，用一抗(用PBS 按照1∶1000 稀釋使用)在4℃孵育過夜，TBST 洗膜后用二抗在室溫下孵育1h，二抗均為HRP 標記的羊抗鼠/兔IgG(用PBS 按1∶5000 的比例稀釋)。Millipore 公司的顯影液顯影并拍照分析。

(3)ELISA 法分析融合蛋白對腫瘤細胞的免疫結合活性:將結腸癌細胞株HCT-15 接種于96 孔板(約為1 ×104個細胞/孔)，培養(yǎng)24h 后，預冷的甲醇(50 微升/孔)冰上固定20min。PBS 洗后，用1%BSA 溶液室溫封閉2h。PBST 緩沖液洗3 次，200 微升/孔，每次5min，共洗3 次。將待測蛋白(Ec-LDP-Hr 及對照LDP)按摩爾數(shù)單位對比稀釋后加入到96孔板中，50 微升/孔，每個濃度設3 個平行孔。于4℃靜置孵育過夜后，加入抗His-Tag 單克隆抗體(用PBS 按1∶2000 稀釋使用)，37℃孵育2h。PBST 洗3 次后，加入HRP 標記的羊抗鼠IgG 抗體(用PBS 按1 ∶2500 稀釋)，37℃孵育2h。用PBST 洗板5 次后，加入TMB 底物溶液，100 微升/孔，室溫避光反應10 ～20min。直接加入2mol/L 的硫酸溶液100 微升/孔終止反應。在酶標儀上測定450nm 處的吸光值OD450。

(4)細胞免疫熒光檢測融合蛋白與腫瘤細胞的結合:將HCT-15 細胞鋪于24 孔板中，培養(yǎng)至70%左右的融合度時PBS 洗1 次，預冷的甲醇置冰上固定30min。用1%BSA 室溫封閉2h。加入1mg/ml 融合蛋白于4℃靜置孵育過夜。加入抗His-Tag 抗體(用PBS 按1∶200 稀釋)37℃孵育2h。PBS洗后加入TRITC 標記的羊抗鼠IgG 抗體(用PBS 按1∶200 稀釋使用)37℃避光孵育2h。PBS 洗后再用抗HER-2 的兔單克隆抗體(用PBS 按1 ∶200 稀釋使用)4℃避光孵育過夜。PBS 洗后加入FITC 標記的羊抗兔IgG 抗體(用PBS 按1∶200稀釋)37℃避光孵育2h。PBS 洗后再加入DAPI(終濃度為2μg/ml)置室溫避光反應15min 染細胞核。用PBS 洗3 次后，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

(5)平板克隆形成實驗檢測融合蛋白對腫瘤細胞的克隆形成影響:取對數(shù)生長期的HCT -15 細胞，消化并吹打成單個細胞，將細胞懸液用培養(yǎng)基稀釋，每組細胞分別以每毫升50個細胞的密度接種24 孔板中，每孔1ml，每組設3 個復孔，使細胞分散均勻。培養(yǎng)24h 后待細胞貼壁，在不同組中加入融合蛋白Ec-LDP-Hr 及對照LDP，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。當培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(約為10 天)，終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定。鏡下計數(shù)＞50 個細胞的克隆數(shù)。

(6)MTT 法檢測融合蛋白對腫瘤細胞的增殖影響:將對數(shù)生長期的HCT-15 細胞胰酶消化后，對其進行細胞計數(shù)，稀釋至5 ×104/ml，接種于96 孔板，每孔100μl，每組設3 個復孔。24h 待細胞貼壁后，分別加入50μg/ml 的蛋白Ec -LDP-Hr 和LDP，分別于0、24、48 和72h 時，加入MTT(終濃度為200mg/L)，于37℃靜置4h。棄去上清，每孔加DMSO 溶液150μl，溶解結晶10min，檢測波長為570nm 的吸光值，每組取3 個復孔的平均值。細胞生存率的計算如下:細胞生存率(%)=(實驗孔OD 值-對照孔OD 值-空白孔OD 值)/(對照孔OD 值-空白孔OD 值)×100%

(7)雙染法強化融合蛋白Ec-LDP-Hr -AE 對腫瘤細胞凋亡的影響:此檢測方法主要使用寶賽生物技術公司的Annexin Ⅴ-FITC 凋亡檢測試劑盒。具體步驟參照試劑盒說明書。

(8)動物實驗:選用BALB/c 裸鼠，雌性，體重18 ～20g。在小鼠右側腋下接種瘤塊，待瘤塊長至50 ～100mm3大小時，將裸鼠按照瘤塊大小和體重進行分組，使每組瘤塊大小平均值接近，且各組體重平均值接近，每組6 只，共4 組。對小鼠進行不同的給藥處理方式，密切觀察腫瘤的生長和小鼠的體重，并隔天測量。實驗期間隔天測量一次腫瘤直徑和體重，根據(jù)公式V=ab2/2 計算腫瘤體積(a. 腫瘤長徑，b. 腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線，并觀察實驗小鼠體重變化。

(9)統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)使用Excel 處理并作圖，用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0 進行單因素ANOVA 分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.融合蛋白Ec -LDP-Hr 與腫瘤細胞的結合活性:根據(jù)文獻［6］制備融合蛋白Ec -LDP -Hr。筆者檢測了3 種結腸癌細胞中靶點EGFR 和HER -2 的表達情況，如圖1 所示，在HCT-15、HCT-116 和HT-293 細胞中，兩個靶點均有較高表達。選取HCT -15細胞檢測融合蛋白對其的結合活性(圖2)，與對照LDP 相比，融合蛋白Ec-LDP -Hr 與HCT -15 細胞結合明顯，且隨蛋白濃度增加而增加。為更直觀的觀察蛋白與細胞的結合，再用細胞免疫熒光技術檢測(圖3)，可見融合蛋白(紅色熒光代表)與在細胞核(藍色熒光代表)周圍定位，這說明融合蛋白與細胞能發(fā)生免疫結合。

圖1 Western blot 法檢測3 種結腸癌細胞中EGFR 和HER-2 的表達水平

圖2 ELISA 檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 及對照蛋白LDP 與HCT-15 的結合情況

圖3 細胞免疫熒光檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 與HCT-15 細胞的結合(×400)

2.融合蛋白Ec -LDP -Hr 對HCT -15 的增殖影響:融合蛋白能靶向結合HCT-15 細胞，為研究其對細胞增殖的影響，首先用平板克隆實驗檢測，如圖4 所示，融合蛋白Ec -LDP -Hr 和對照蛋白LDP 對HCT-15 細胞的克隆形成均有一定的抑制，且隨蛋白濃度增加，抑制作用增加。當?shù)鞍诐舛葹?5μg/ml和50μg/ml 時，Ec -LDP -Hr(50μg/ml)的抑制作用明顯強于LDP(P ＜0.01)。同時，MTT 法也驗證了融合蛋白對HCT -15 細胞的生長抑制作用(圖5)，在48 和72h 時，其抑制作用明顯強于對照蛋白LDP。為探討融合蛋白對腫瘤細胞增殖影響的機制，筆者用Western blot 法檢測用蛋白處理后的HCT-15 細胞中EGFR 和HER-2 的表達情況(圖6)，隨著蛋白濃度增加，EGFR 和HER -2 表達量明顯降低，這說明融合蛋白Ec - LDP - Hr 與靶點EGFR/HER -2 結合后，通過抑制此信號通路來抑制腫瘤細胞的增殖。

圖4 融合蛋白Ec-LDP-Hr 和對照蛋白LDP 對結腸癌細胞HCT-15 的克隆形成抑制作用

圖5 MTT 法檢測50μg/ml 融合蛋白Ec-LDP-Hr 和對照蛋白LDP 對結腸癌細胞HCT-15 的生長抑制作用

圖6 Western blot 法檢測融合蛋白Ec-LDP-Hr 對HCT-15 細胞中EGFR 和HER-2 的表達影響

3.強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對HCT -15 細胞的體外殺傷活性:融合蛋白Ec -LDP -Hr 與力達霉素發(fā)色團分子在體外進行組裝，得到強化的融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE。MTT 檢測Ec-LDP-Hr-AE 對體外培養(yǎng)的人結腸癌細胞HCT -15 有強烈的殺傷作用，其IC50值為3.05 ×10-10mol/L。此外，筆者采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染結合流式細胞術的方法檢測了強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對HCT-15 細胞誘發(fā)凋亡的現(xiàn)象。不同濃度的Ec -LDP-Hr -AE 處理細胞24h 后，細胞均已出現(xiàn)凋亡的情況，且凋亡的比率隨Ec -LDP -Hr -AE 濃度的增加而增高(圖7)。0.1、1.0、10.0nmol/L 的Ec -LDP-Hr -AE 作用于HCT -15 細胞的凋亡率分別為2.550% ±0.002%、3.300% ±0.001%和15.050%±0.003%，顯著高于對照組的0.310% ±0.000%。此結果顯示強化的融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 在低濃度下24h 內(nèi)即可誘導腫瘤細胞的凋亡，這也是其導致細胞死亡的機制之一。

圖7 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法結合流式細胞術檢測Ec-LDP-Hr-AE 對HCT-15 細胞的凋亡誘導作用

4.聯(lián)合融合蛋白Ec -LDP-Hr 及強化蛋白對裸鼠結腸癌移植瘤生長抑制作用:融合蛋白Ec-LDPHr 及強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 聯(lián)合的體內(nèi)抗腫瘤活性研究采用了人結腸癌HCT -15 裸鼠移植瘤模型。本次實驗共使用24 只雌性裸鼠，分為6 組，每組6 只。分別為對照組、融合蛋白Ec -LDP -Hr(20mg/kg)組、強化融合蛋白Ec - LDP - Hr - AE(0.4mg/kg)組及聯(lián)合Ec -LDP -Hr 和Ec -LDP -Hr-AE 組。當裸鼠皮下腫瘤體積達到50 ～100mm3時，將Ec-LDP-Hr 和Ec-LDP-Hr-AE 通過尾靜脈注射給藥。第1 次給藥后的第7 天，按照相同的劑量再次通過尾靜脈給藥1 次。實驗期間每隔1 天測量1 次腫瘤直徑，并稱量小鼠體重。根據(jù)公式V =ab2/2 計算腫瘤體積(a. 腫瘤長徑，b. 腫瘤短徑)，繪制腫瘤生長曲線(圖8A)，觀察體重變化，并繪制小鼠體重曲線(圖8B)。在第29 天處死動物，計算抑瘤率。實驗結果顯示，雙特異性融合蛋白Ec - LDP -Hr(20mg/kg)對人結腸癌移植瘤HCT -15 有一定的抑制作用，其抑瘤率為37.6%，而強化的融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE 的抑瘤效果(56.7%)明顯強于未強化的蛋白，將兩者進行聯(lián)合，抑制率又有進一步提高到71.4%，其CDI 值為1，說明融合蛋白Ec -LDP -Hr 與強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 在體內(nèi)有聯(lián)合相加作用。在整個實驗治療期間，監(jiān)測小鼠體重顯示3 種給藥組使小鼠體重下降不明顯(低于原體重的20%)，小鼠能夠耐受所給的劑量。

圖8 聯(lián)合融合蛋白Ec-LDP-Hr 及其強化形式Ec-LDP-Hr-AE 對裸鼠結腸癌HCT-15 移植瘤的治療作用

討 論

結腸癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其癌癥病死率也位居第2 位，大約有1/4 的患者確診時就伴有轉移［7］。雖然結合手術治療和放化療能明顯改善結腸癌患者的預后，但由于結腸癌較高的發(fā)生率和病死率，加上傳統(tǒng)藥物的不良反應大，還需不斷探尋新的治療手段［8］。近年來，腫瘤的靶向治療受到大家的關注，許多學者致力于對腫瘤標志物的鑒定。分子靶向藥物具有特異性強的特點，因而逐漸成為當今抗腫瘤藥物的研究熱點。在治療轉移性結腸癌中，EGFR 就是較理想的抗腫瘤治療靶點［9］。研究表明靶向EGFR 治療能改善轉移性結腸癌患者的預后［10］?，F(xiàn)在有兩種抗EGFR 抗體，帕尼單抗(panitumumab，IgG2 型)和西妥昔單抗(cetuximab，IgG3 型嵌合抗體)，已經(jīng)用于臨床上對轉移性結腸癌的治療。除了單純的單克隆抗體藥物，還有一些基于抗體的藥物用于抗腫瘤研究，如抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)、免疫毒素和免疫脂質(zhì)體［11］。這類藥物不僅能夠通過阻斷配受體結合或阻止受體二聚體化抑制腫瘤增殖，其偶聯(lián)的化療藥物還能發(fā)揮強大的腫瘤殺傷力［12，13］。事實證明，聯(lián)合基于抗體的靶向治療(針對腫瘤特異性高表達靶點如EGFR、HER-2 等)比單獨用藥效果更好［14］。因此，腫瘤治療中抗體藥物、化療藥物和其他藥物聯(lián)合治療會取得更好的療效。

有報道指出，針對靶點EGFR 和HER-2 研制的一種強化雙特異性融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE，屬于抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)。該融合蛋白對高表達EGFR 或HER -2 的腫瘤細胞有較好的親和性，強化的融合蛋白組裝有力達霉素的烯二炔發(fā)色團AE，作為“彈頭”分子對腫瘤細胞具有很強的殺傷作用［15］。在以往的報道中，具有靶向功能的融合蛋白Ec-LDP-Hr 只是作為發(fā)色團的一種靶向載體工具來研究，并沒有深入探討融合蛋白對腫瘤細胞的生物學活性。在本實驗中，筆者首先驗證了融合蛋白Ec -LDP -Hr 對高表達HER -2 和EGFR 的結腸癌腫瘤細胞HCT-15 的結合活性，并發(fā)現(xiàn)融合蛋白Ec -LDP -Hr 能抑制HCT -15 的生長和克隆形成，這可能是通過抑制腫瘤細胞靶點EGFR/HER -2 的表達而產(chǎn)生的。同樣，強化融合蛋白Ec -LDP -Hr -AE 對HCT-15 細胞也有很強的細胞毒性，在較低濃度(10-10mol/L)就能引起腫瘤細胞的凋亡。在結腸癌裸鼠移植模型中發(fā)現(xiàn)，融合蛋白Ec -LDP -Hr 能在一定程度發(fā)揮抑瘤效果，并且該融合蛋白及其強化融合蛋白聯(lián)合有相加作用，抗腫瘤效應比單獨給藥要強。

綜上所述，基于抗體CDR 和配體寡肽的EGFR/HER-2 雙靶向融合蛋白Ec - LDP - Hr 不僅具有“導向”載體作用，還有一定的抗腫瘤活性。聯(lián)合融合蛋白Ec-LDP-Hr 及其強化形式Ec-LDP-Hr -AE 可能為高表達靶點EGFR/HER-2 的結腸癌提供一種新的治療策略。

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