針對(duì)ALK4 基因的TALEN 質(zhì)粒構(gòu)建與活性鑒定

曾凡才 顧洪 王軻 周紅

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054；2.瀘州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，瀘州 646000）

TGF-β 超家族包括40 個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)成員，它們參與細(xì)胞的增殖、分化、粘附、遷移和凋亡等生物學(xué)效應(yīng)［1，2］。這些成員通過與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的兩種膜受體（Ⅰ型和II 型）結(jié)合和裝配

發(fā)揮作用，一般是配體分子先與II 型受體結(jié)合后招募和激活Ⅰ型受體，激活的Ⅰ型受體促使下游信號(hào)分子Smads 磷酸化，磷酸化的Smads 從胞質(zhì)穿梭到核并調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［3，4］。至今，已發(fā)現(xiàn)5 種哺乳動(dòng)物II 型受體（TβR-II、ActR-IIA、ActR-IIB、BMPR-II 和AMHR-II）和7 種I 型受體（Activin receptor-like kinase 1-7，ALK1-7）［5］，其中Activin 的II 型受體（ActRIIA 和ActRIIB）和Ⅰ型受體（ALK4）除與Activins 形成復(fù)合物外，還結(jié)合GDF1、GDF3、GDF8（myostatin）和Nodal 等家族成員，同時(shí)這些配體也激活A(yù)LK4 以外的其它受體信號(hào)［6］。因此，為了更好地研究這些配體和受體的功能及其相互關(guān)系，敲除該信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的Ⅰ型受體ALK4，對(duì)闡明這些復(fù)雜的信號(hào)通路具有重要意義。

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）是一種設(shè)計(jì)簡便、特異性好和毒性低的基因敲除技術(shù)。自2010年底應(yīng)用于基因敲除［7］，目前已在大鼠、小鼠、斑馬魚、酵母、植物和人類細(xì)胞等多種生物體中成功應(yīng)用［8］。TALEN 的設(shè)計(jì)理念主要來自類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（Transcription activator-like effector，TALE）和另一基因敲除技術(shù)鋅指核酸酶（Zinc-finger nuclease，ZFN）的研究成果。TALE 是主要存在于植物病原體黃單胞菌的一類高度保守的蛋白家族［9］。TALE 的結(jié)構(gòu)主要由N 末端的轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域（TS）、中間DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C 末端的核定位信號(hào)（NLS）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）組成。TALE 的不同主要在于DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中重復(fù)片段的數(shù)量和重復(fù)可變的雙殘基（Repeat variable di-residue，RVD）［10］。RVD 是指每個(gè)重復(fù)單位中+12 和+13 位的氨基酸殘基，它們是實(shí)現(xiàn)靶向特異識(shí)別DNA 堿基的關(guān)鍵位點(diǎn)，隨靶點(diǎn)核苷酸序列的不同而異。2009 年，兩個(gè)研究小組分別闡明了TALE 蛋白中RVD 與靶序列堿基的對(duì)應(yīng)關(guān)系，最常見的4 種RVD 與堿基的識(shí)別關(guān)系分別是NI（Asn Ile）-A、NG（Asn Gly）-T、HD（His Asp）-C 和NN（Asn Asn）-G［11，12］。通過TALE 蛋白的氨基酸識(shí)別堿基規(guī)則，結(jié)合鋅指核酸酶的研究成果將TALE 中的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）替換成核酸內(nèi)切酶（Fok Ⅰ）的切割結(jié)構(gòu)域，即構(gòu)建為TALEN。人們只要將TALEN 的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域替換為設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)識(shí)別域，即可對(duì)基因組的特定靶點(diǎn)進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)基因打靶。因此，TALEN 技術(shù)的關(guān)鍵步驟是TALEN 靶點(diǎn)識(shí)別域的構(gòu)建。本試驗(yàn)采用改進(jìn)后的質(zhì)粒文庫快速直接構(gòu)建法，只需一步即可完成構(gòu)建反應(yīng)。鑒于ALK4 在TGF-β 超家族信號(hào)通路中的重要性和信號(hào)通路本身的復(fù)雜性，本研究詳細(xì)介紹用于敲除ALK4 基因的TALEN 質(zhì)粒構(gòu)建過程，并進(jìn)一步鑒定其活性，為建立不同的ALK4 基因敲除細(xì)胞系，研究ALK4 基因的功能及其與不同配體之間的關(guān)系做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HEK293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑和引物 嘌呤霉素購自Sigma 公司；Taq DNA 聚合酶、基因組DNA 提取試劑盒、高純度中抽質(zhì)粒提取試劑盒、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購自天根生物有限公司；BamH I、EcoR I 和Hha I 核酸內(nèi)切酶、小抽質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物（大連）公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自羅氏公司；卡那霉素購自上海生工；LipofectamineTM2000、DMEM 高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM 液體培養(yǎng)基購自Invitrogen 公司；pEGFPN1 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；TALEN 試劑盒購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司；測序和引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。本研究所用引物序列如表1 所示。

表1 測序及PCR 擴(kuò)增所用引物序列

1.2 方法

1.2.1 確定ALK4 基因的靶位點(diǎn)和識(shí)別序列 從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）搜索到ALK4 基因序列。利用TALEN 設(shè)計(jì)專業(yè)網(wǎng)站（https：//tale-nt.cac.cornell.edu/），根據(jù)天然TALEs 識(shí)別序列的特征和TALEN 靶點(diǎn)的選擇原則［13］，并綜合考慮ALK4的不同剪接異構(gòu)體序列，最終確定一個(gè)作用靶點(diǎn)和TALEN 左右臂識(shí)別序列。

1.2.2 根據(jù)識(shí)別序列構(gòu)建質(zhì)粒 采用上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司的TALEN 試劑盒構(gòu)建TALEN 質(zhì)粒。這種方法基于含有TALEN 的DNA 結(jié)合重復(fù)序列的172 個(gè)質(zhì)粒文庫模塊（圖1），將左、右臂識(shí)別序列的最后一位T 去除，以1 個(gè)或2 個(gè)堿基組合為一個(gè)模塊，首個(gè)標(biāo)記為1，最后一個(gè)標(biāo)記為9，依次類推進(jìn)行標(biāo)記。每次必須選擇9 個(gè)模塊，最后兩個(gè)模塊必須為雙模塊。左右臂標(biāo)記情況見圖1，其中以右臂為例，模塊選擇情況見圖中粗體加下劃線顯示，左臂按照相同方法構(gòu)建。

圖1 TALEN 左右臂的模塊選擇

每 個(gè) 模 塊 取1.5 μL，9 個(gè) 模 塊 共13.5 μL。連接反應(yīng)體系如下：9 個(gè)模塊 13.5 μL，左臂或右臂TALEN 骨架載體 1.5 μL，溶液3 2.0 μL，溶液1 1.0 μL，溶液2 1.0 μL，ddH2O 1.0 μL?？傮w積為20 μL?；靹蚝笤赑CR 儀中連接，反應(yīng)程序如下：37℃ 5 min，16℃ 10 min，15 個(gè) 循 環(huán)；80℃ 10 min；12℃ 1 min。取出PCR 管并加入1 μL 溶液4 和0.5 μL 溶液5，混勻，37℃孵育1 h，轉(zhuǎn)化后涂板于含卡那霉素的LB 瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。其中，溶液1-5為TALEN 試濟(jì)盒中所配。

1.2.3 酶切鑒定 從平板中挑取15 個(gè)單克隆菌落，在含卡那霉素的LB 瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，同時(shí)接種于5 mL 含抗卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中，37℃ 250 r/min 培養(yǎng)16 h。用常規(guī)質(zhì)粒小抽試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切：ddH2O 8 μL，10×K Buffer 2 μL，Plasmid 8 μL，BamH I 1 μL，EcoR I 1 μL；總體積20 μL。置于37℃水浴中孵育1 h。在1%瓊脂糖中電泳鑒定，根據(jù)酶切后片段大小，選擇符合條件的單克隆測序。

1.2.4 BLAST 比 對(duì) 在 網(wǎng) 址http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 中選擇tblastx（使用氨基酸比對(duì)），勾選Align two or more sequences（兩序列或更多序列比對(duì)），將拼接好的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列和測序序列分別輸入到上、下文本框中，在BLAST 比對(duì)結(jié)果中查找比對(duì)正確的結(jié)果。比對(duì)正確的質(zhì)粒進(jìn)行反向測序，其中右臂TALEN 表達(dá)質(zhì)粒由于插入片段較長，除正反方向測序外，還在中間設(shè)計(jì)引物以便測序完整（測序引物見表1）。經(jīng)BLAST 比對(duì)完全正確的單克隆，用中抽質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.5 最低嘌呤霉素濃度的確定 TALEN 質(zhì)粒帶有抗嘌呤霉素基因，可利用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，其最低濃度由以下試驗(yàn)確定：取對(duì)數(shù)生長期HEK293T 細(xì)胞，生長于24 孔板（1×105個(gè)/孔），24 h 后分別加入含0、0.5、1、2、3 和4 μg/mL 嘌呤霉素的新鮮篩選培養(yǎng)基，每天更換篩選培養(yǎng)基且監(jiān)測存活細(xì)胞數(shù)量，最終確定3-4 d 能殺死所有細(xì)胞的最低嘌呤霉素濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期HEK293T 細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，24 h 后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系如下：左臂TALEN 質(zhì)粒 2 μg，右臂TALEN 質(zhì) 粒 2 μg，pEGFP-N1 質(zhì) 粒 0.5 μg，Opti-MEM 2×250 μL，LipofectamineTM2000 13.5 μL； 對(duì)照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染。24 h 后觀察GFP 表達(dá)并替換成含2 μg/mL 嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基。每天更換篩選培養(yǎng)基，觀察到對(duì)照細(xì)胞全部死亡后，收集試驗(yàn)組細(xì)胞，一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，一半細(xì)胞用于提取基因組DNA。對(duì)照組不進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和不加篩選培養(yǎng)基，直接提取基因組DNA。

1.2.7 PCR 擴(kuò)增和酶切鑒定 提取HEK293T 細(xì)胞基因組DNA，定量后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：基因組DNA 2 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、2.5 mmol/L Mg2+4 μL、10 pmol/L ALK4-TALEN-F 和ALK4-TALEN-R 各1 μL、Taq DNA 聚合酶1 μL、10×PCR Buffer 5 μL 和ddH2O 35 μL。擴(kuò) 增 程 序 為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 min，72℃ 30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物電泳鑒定，剩余PCR 產(chǎn)物純化后Hha Ⅰ內(nèi)切酶處理：Hha Ⅰ 1 μL，10×M Buffer 2 μL，PCR 產(chǎn) 物12 μL，ddH2O 5 μL；總體積20 μL。37℃水浴中孵育3 h，3%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照和灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 ALK4基因的靶位點(diǎn)及TALEN識(shí)別序列的確定

根據(jù)Bogdanove 和Voytas 描述的TALEN 靶位點(diǎn)選擇原則，在ALK4 基因的TALEN 靶位點(diǎn)左右臂識(shí)別序列5'端的前一位（第0 位）堿基都為胸腺嘧啶（T），且靶序列的最后一個(gè)堿基（3'端堿基）也都是胸腺嘧啶（T）（對(duì)應(yīng)于最后的0.5 個(gè)TALE 重復(fù)單元）。左臂識(shí)別序列的長度為15 bp，右臂識(shí)別序列的長度為18 bp，中間間隔序列的長度為21 bp，間隔序列中有Hha Ⅰ酶切位點(diǎn)，可用于判斷TALEN質(zhì)粒的活性（圖2）。90%人類基因都有剪切異構(gòu)體，目前發(fā)現(xiàn)至少有3 種可編碼蛋白的ALK4 剪接異構(gòu)體，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的TALEN 質(zhì)?？勺饔糜贏LK4 基因的3 種剪接異構(gòu)體的第二外顯子（圖3）。為了避免SNP 影響TALEN 的識(shí)別效果，PCR 擴(kuò)增HEK293T細(xì)胞基因組中的靶序列并測序，發(fā)現(xiàn)靶序列與設(shè)計(jì)識(shí)別序列完全一致（圖4）。

2.2 TALEN質(zhì)粒構(gòu)建及酶切鑒定

構(gòu)建的左右臂TALEN 質(zhì)粒均挑取15 個(gè)單克隆菌落，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖5）。TALEN 左臂骨架載體為5 057 bp，其中BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ兩酶切位點(diǎn)之間的片段為803 bp。構(gòu)建敲除ALK4 基因的TALEN 左臂質(zhì)粒在BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)之間插入識(shí)別重復(fù)單位，左臂質(zhì)粒插入15 bp 的識(shí)別序列，除最后一個(gè)堿基胸腺嘧啶（T）設(shè)計(jì)在載體骨架上外，還需插入14 個(gè)堿基的識(shí)別序列，每個(gè)堿基的識(shí)別序列由102 bp 核苷酸組成，因此需在骨架載體中插入1 428 bp 的核酸片段。如果構(gòu)建正確，TALEN 左臂表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)上述雙酶切和電泳分離后應(yīng)觀察到4 254 bp 和2 231 bp 的兩條片段，據(jù)此分析判斷L7 最符合此條件（圖5），用于測序。右臂骨架質(zhì)粒缺少抗嘌呤霉素基因，只有3 792 bp 大小，雙酶切位點(diǎn)之間的片段也為803 bp，右臂應(yīng)插入18 個(gè)堿基的識(shí)別序列，除最后一位T 設(shè)計(jì)在載體骨架上外，還需插入1 734 bp 的核酸片段。如果構(gòu)建成功，TALEN 質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和電泳分離后應(yīng)觀察到2 989 bp 和2 537 bp 的兩條片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)R7、R9、R10、R12、R13、R14 和R15 編號(hào)質(zhì)粒均可能構(gòu)建正確（圖5），將它們測序。

2.3 BLAST比對(duì)分析

由于識(shí)別4 種堿基的重復(fù)單位僅在+12 和+13位的氨基酸殘基不一致，因而不論是拼接的標(biāo)準(zhǔn)序列還是測序序列都是一些相似度很高的序列重復(fù)，它們的BLAST 比對(duì)結(jié)果會(huì)有很多，需要從中找到正確的比對(duì)結(jié)果。根據(jù)左臂插入的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列長度為1 428 bp 和L7 質(zhì)粒的測序結(jié)果，正向測序比對(duì)正確的結(jié)果應(yīng)選擇標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列從第1 位，測序序列從第64 位堿基開始進(jìn)行比對(duì)，且兩序列一致性為100%的結(jié)果（圖6-A）；反向測序比對(duì)正確的結(jié)果應(yīng)選擇標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列是以第1 428 位堿基比對(duì)結(jié)束，且對(duì)應(yīng)的反向測序序列應(yīng)在第28 位堿基，兩序列的一致性為100%的結(jié)果（圖6-B）。L7 質(zhì)粒正反向測序比對(duì)正確的結(jié)果中有327 個(gè)核苷酸所編碼的氨基酸重疊且序列完全一致（圖6），說明TALEN左臂質(zhì)粒L7 構(gòu)建成功。其它質(zhì)粒以相同方法分析，結(jié)果與L7 質(zhì)粒類似（圖略）。右臂質(zhì)粒正向測序結(jié)果表明R13 存在一個(gè)位點(diǎn)的突變，其它質(zhì)粒序列正確。選擇其中R9 和R12 進(jìn)行完整測序，BLAST 比對(duì)確認(rèn)右臂R9 和R12 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖6 L7 質(zhì)粒序列BLAST 比對(duì)結(jié)果

2.4 TALEN質(zhì)粒的活性鑒定

通過共轉(zhuǎn)染24 h 的pGFP-N1 質(zhì)粒，熒光顯微鏡觀察到至少60%的轉(zhuǎn)染效率（圖7）。同時(shí)利用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，以最低嘌呤霉素濃度試驗(yàn)確定的2 μg/mL 嘌呤霉素在加藥3 d 時(shí)可致未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染TALEN 質(zhì)粒的HEK293T 細(xì)胞還剩余至少50%，一定程度反映了轉(zhuǎn)染效率。用ALK4 基因靶序列兩端設(shè)計(jì)的PCR 引物擴(kuò)增HEK293T 細(xì)胞基因組DNA，電泳結(jié)果表明無論是否轉(zhuǎn)染TALEN 質(zhì)粒都可獲得與預(yù)期371 bp 一致的特異帶（圖8）。此PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)Hha Ⅰ內(nèi)切酶酶切，未轉(zhuǎn)染組的PCR 產(chǎn)物完全被切開，生成與預(yù)期297 bp 和74 bp一致的兩條帶，而轉(zhuǎn)染TALEN 質(zhì)粒的一部分PCR產(chǎn)物未被切開，灰度分析大約占總條帶的10%，說明其Hha Ⅰ內(nèi)切酶位點(diǎn)已發(fā)生突變，部分HEK293T細(xì)胞的ALK4 基因被敲除（圖9）。此外，L7+R9 和L7+R12 兩個(gè)質(zhì)粒組合因?yàn)樽R(shí)別序列一樣，作用于靶點(diǎn)的活性也基本相同（圖9）。

3 討論

本研究綜合考慮靶點(diǎn)選擇原則和ALK4 剪接異構(gòu)體的共同序列，最終將靶點(diǎn)確定在ALK4 基因的第二外顯子，確保如果ALK4 基因被敲除后，ALK4功能不會(huì)被其剪接異構(gòu)體所補(bǔ)償。靶序列中間有一Hha Ⅰ酶切位點(diǎn)以方便判斷質(zhì)?；钚裕?4］。如果識(shí)別序列中只要有一個(gè)堿基出現(xiàn)錯(cuò)配就有可能較大幅度地降低TALEN 的活性。因此，通過PCR 擴(kuò)增HEK293T 細(xì)胞基因組中的靶序列并測序，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該段序列在HEK293T 細(xì)胞基因組中不存在SNP現(xiàn)象。通過一步法構(gòu)建TALEN 質(zhì)粒，用酶切鑒定和測序，最后通過BLAST 序列比對(duì)成功獲得敲除ALK4 基因的TALEN 質(zhì)粒，并用酶切鑒定的方法證明在HEK293T 細(xì)胞中有一定活性。

與其它基因敲除技術(shù)相比，TALEN 簡便實(shí)用，理論上可作用于基因組中的任何位點(diǎn)［15］。目前TALEN 的構(gòu)建方法包括DNA 序列直接合成、Golden Gate 克隆、PCR 與Golden Gate 克隆結(jié)合、Toolbox組裝、基于同尾酶的單元組裝、FLASH 組裝和LIC組裝等，它們各有特點(diǎn)［14，16-18］。例如，北京大學(xué)張博［19］課題組開發(fā)的基于同尾酶的單元組裝法已在斑馬魚的基因敲除中取得很好的效果，該方法費(fèi)用較低，但步驟較多。如果構(gòu)建TALEN 較多，積累了較多不同重復(fù)單元的模塊后，效率也比較高。本研究采用改進(jìn)后的質(zhì)粒文庫快速直接構(gòu)建，可通過一步連接反應(yīng)構(gòu)建識(shí)別序列為12-19 bp 之間任意長度的TALEN 質(zhì)粒。一般挑選15 個(gè)克隆即可篩選到構(gòu)建正確的質(zhì)粒，而且在TALEN 載體質(zhì)粒上設(shè)計(jì)有嘌呤霉素抗性基因，可用嘌呤霉素提高篩選效率。

TGF-β 超家族信號(hào)通路中存在一個(gè)配體作用于多個(gè)受體，一個(gè)受體也可接受多個(gè)配體信號(hào)這一復(fù)雜現(xiàn)象。為揭示這種復(fù)雜的關(guān)系，敲除其中的重要基因是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。ALK4 作為多種TGF-β 超家族成員的受體分子，在這一復(fù)雜的關(guān)系中處于關(guān)鍵位置，但早期研究表明敲除ALK4 基因?qū)е屡咛ニ劳觯?0］，因此限制了對(duì)ALK4 基因功能的研究。最近發(fā)展起來的TALEN 基因敲除技術(shù)方便快捷，希望能利用該技術(shù)建立敲除ALK4 基因的不同細(xì)胞系，以研究ALK4 的功能。

本研究成功構(gòu)建了敲除ALK4 基因的TALEN 質(zhì)粒，并證明在HEK293T 細(xì)胞中有一定的活性。雖然通過觀察共轉(zhuǎn)染的GFP 表達(dá)以及嘌呤霉素的篩選都證明TALEN 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率較高，但TALEN的切割效率可能并不高，導(dǎo)致發(fā)生基因組突變的HEK293T 細(xì)胞并不多。這說明TALEN 技術(shù)雖在多個(gè)物種已取得成功，但不能保證每個(gè)位點(diǎn)都有高活性。這是因?yàn)門ALEN 這一新興技術(shù)還沒有完全被認(rèn)識(shí)，但其有效性是肯定的。我們下一步將通過大量篩選細(xì)胞得到敲除ALK4 基因的細(xì)胞系或者在同一位點(diǎn)設(shè)計(jì)多條左右臂TALEN 質(zhì)粒，組合使用這些質(zhì)粒以篩選到更高活性的TALEN 質(zhì)粒。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了敲除ALK4 基因的TALEN質(zhì)粒，并采用脂質(zhì)體法導(dǎo)入HEK293T 細(xì)胞，且TALEN 質(zhì)粒有一定的活性。

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