牦牛TLR6基因的克隆、序列分析及其表達(dá)分布研究

林寶山，蘭道亮，黃 偲，陳亞冰，張 雁，王 英，李 鍵,*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；3.四川省動物疾病預(yù)防控制中心，成都 610041）

牦牛TLR6基因的克隆、序列分析及其表達(dá)分布研究

林寶山1，蘭道亮2，黃 偲1，陳亞冰1，張 雁1，王 英3，李 鍵1,2*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；3.四川省動物疾病預(yù)防控制中心，成都 610041）

為了解牦牛TLR6基因特點(diǎn)及其在牦牛各組織動態(tài)表達(dá)分布規(guī)律，根據(jù)GeneBank中野牦牛TLR6序列設(shè)計引物克隆并對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立熒光定量PCR方法，對TLR6基因在牦牛組織中的表達(dá)分布進(jìn)行研究?；蛐蛄蟹治霰砻?，克隆得到牦牛TLR6基因編碼區(qū)全長2 397 bp，編碼氨基酸798個，N端含有26個氨基酸組成的信號肽，分子質(zhì)量91.5719 ku，理論等電點(diǎn)6.45。蛋白預(yù)測結(jié)果表明，TLR6編碼蛋白整體表現(xiàn)為疏水性。同源性分析表明，10條序列當(dāng)中牦牛與野牦牛、普通牛、藏羚羊等物種具有較高同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。該結(jié)果說明TLR6基因序列具有較高保守性。熒光定量結(jié)果表明，TLR6基因在牦牛所有組織中均有表達(dá)，TLR6基因在脾臟表達(dá)量最高，在肌肉表達(dá)量最低，在卵巢、肺、小腸、肝、腎、心等組織依次有較高表達(dá)。該結(jié)果可為進(jìn)一步研究TLRs在牦牛等其他高原動物體內(nèi)的分布及動態(tài)表達(dá)規(guī)律，以及牦牛抗病免疫及育種奠定基礎(chǔ)。

牦牛；TLR6；克?。粺晒舛縋CR；組織表達(dá)分布

TLRs是進(jìn)化中較保守的模式識別受體，是迄今認(rèn)識較早的機(jī)體通過感知微生物病原體直接做出防御反應(yīng)的天然免疫受體，在天然免疫防御中起重要作用[1]，可直接識別病原微生物表面PAMP，激活基因調(diào)節(jié)先天免疫并建立獲得性免疫。Takeu?chi等報道，TLR6作為TLRs家族成員，TLR6通過激活抗原遞呈細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞對微生物抗原做出應(yīng)答，參與免疫性疾病的調(diào)節(jié)[2]。研究證實，TLR6不直接識別配體，而是通過與TLR2配對形成異源二聚體提高TLR2對配體識別能力，識別如革蘭陽性菌的肽聚糖和脂多肽、真菌的酵母聚糖、分枝桿菌、螺旋體和支原體等病原微生物產(chǎn)物[3]。

牦牛對青藏高原高寒、低氧等惡劣氣候環(huán)境有極強(qiáng)適應(yīng)性。布氏桿菌病、口蹄疫、犢牛腹瀉等疾病的發(fā)生，嚴(yán)重阻礙藏區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前，國內(nèi)外對于TLR6基因的相關(guān)研究甚少，主要集中在多態(tài)性方面，Tantisira等對TLR6基因單核苷酸多態(tài)性頻率及其在哮喘初步診斷中的作用加以研究[4]，魏麟等進(jìn)行豬TLR6基因MspⅠ多態(tài)性與生長性狀相關(guān)性研究[5]，Isamu等進(jìn)行感染分支桿菌的基因敲除小鼠TLR2和TLR6基因研究[6]，但TLR6在牦牛及其他高原動物疾病等方面相關(guān)基礎(chǔ)研究尚屬空白。本研究首次克隆牦牛TLR6基因序列，并利用相關(guān)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計特異性引物建立熒光定量方法對其在牦牛體內(nèi)動態(tài)表達(dá)規(guī)律及組織表達(dá)分布進(jìn)行研究，為今后TLR6基因在牦牛及其他高原動物傳染病的發(fā)生、治療、預(yù)防及其免疫機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所有牦牛組織采自成都市青白江唐家寺向陽屠宰場，屬于麥哇牦牛（四川阿壩，海拔3 500 m）。分別采集母牦牛3頭11種組織樣本（心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺），均放入液氮中送回西南民族大學(xué)細(xì)胞胚胎工程實驗室保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

稱量約1 g組織樣至液氮中預(yù)研磨后，按照RNAprep pure動物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)]提取總RNA。按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司生產(chǎn)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用20 μL體系：Oligo dT181 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor（20 U·μL-1）1 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Re?verse Transcriptase（200 U·μL-1）1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足20 μL，反應(yīng)條件：42℃ 60 min；70℃5 min。cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因克隆

牦牛TLR6克隆引物根據(jù)GenBank中登陸的野牦牛TLR6（XM_005897340.1）基因序列，用Premier 5.0軟件分二段設(shè)計引物，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長度如表1所示。

以牦牛脾臟組織cDNA作為模版，引物為S1、A1、S2、A2進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，取適量已純化PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp+瓊脂平板上涂菌。挑取單個菌落接種于Amp+的LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往上海Invitrogen公司測序。

表1 基因TLR6的克隆引物序列Table 1 Primer sequences of TLR6 gene

1.4 實時熒光定量PCR

熒光定量引物根據(jù)GenBank中登陸的野牦牛TLR6（XM_005897340.1）、β-actin（NM_173979）基因序列，用Premier 5.0軟件各設(shè)計幾對特異性引物，通過普通PCR、熒光定量PCR檢驗引物特異性，并最終確定所使用引物，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長度如表2所示，引物由上海Invitrogen公司合成。

實時熒光定量采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa公司）10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL。使用Bio-Rad公司熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量分析。優(yōu)化處理后每個基因最佳反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，39個循環(huán)，添加1個溶解曲線，設(shè)置以dH2O為模版的陰性對照，每個組織進(jìn)行3次重復(fù)。

表2 基因TLR6和β-actin的熒光定量引物序列Table 2 Real-time PCR primer sequences ofTLR6 and β-actin genes

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

將克隆測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并用DNAStar軟件、BioXM軟件、Cltulax軟件以及http://npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html等軟件對所得序列分析。將熒光定量結(jié)果采用相對定量的2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并用SPASS V19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最后使用Excel制圖功能繪制出牦牛TLR6基因各組織相對表達(dá)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增

牦牛TLR6基因分段擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，擴(kuò)增片段大小分別在1 064、1 324 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小基本相符。利用擴(kuò)增片段測序結(jié)果的重復(fù)序列進(jìn)行拼接，得到牦?？寺∧康幕蛐蛄小?/p>

圖1牦牛TLR6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of TLR6 gene

2.2 基本理化性質(zhì)分析

擴(kuò)增得到牦牛TLR6基因全長2 397 bp，并通過http://web.expasy.org/protparam/等生物信息學(xué)在線軟件對其基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TLR6基因開放閱讀框全長2 397 bp，編碼氨基酸798個，相對分子質(zhì)量91.5719，理論等電點(diǎn)為6.45。氨基酸組成中，正電荷殘基為74個，負(fù)電荷殘基為85個，提示整個蛋白呈負(fù)性。

2.3 TLR6基因編碼產(chǎn)物親/疏水性預(yù)測

利用網(wǎng)上在線工具ExPASy-ProtScale程序預(yù)測該蛋白疏水性（見圖2）。TLR6蛋白疏水性最大值為3.50，最小值為-2.80，在氨基酸序列5～19、425～460、586～612和724～741幾個區(qū)域中都出現(xiàn)較高疏水性，據(jù)此推測這幾個區(qū)富含疏水性氨基酸。

圖2 牦牛TLR6基因親、疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.2 Predict results of hydrophilicity and hydrophobicity of TLR6 in yak

2.4 信號肽預(yù)測

信號肽是指N-端起始密碼子AUG之后的1組密碼子產(chǎn)物，一般為20～30個氨基酸，其作用是引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌。試驗采用SignalP 4.1 Server-predic?tion在線軟件對TLR6蛋白序列進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果見圖3。分析表明該蛋白可能含有32個氨基酸組成的信號肽，此外S值在第26個氨基酸處變化明顯，Y值峰也較突出，綜合判斷該蛋白可能在此點(diǎn)存在剪切位點(diǎn)。

2.5 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測

利用網(wǎng)上在線工具TM-HMM程序預(yù)測TLR6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，該蛋白是由包含兩個跨膜區(qū)構(gòu)成的跨膜蛋白，其中一個跨膜區(qū)定位在12～29位氨基酸，另一個定位在589～611位氨基酸，預(yù)示TLR6蛋白在細(xì)胞內(nèi)作為一種膜受體，胞外區(qū)識別外界信號并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)。

圖3 牦牛TLR6基因蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.3 Predict results of protein signal peptide of TLR6 in yak

圖4 牦牛TLR6基因蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig.4 Predict results of protein transmembrane region of TLR6 in yak

2.6 同源性分析

利用DNAStar軟件子程序MegAlign的Clustal W方法與GenBank中公布的部分物種TLR6基因序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，牦牛TLR6基因與其他9條序列相比，同源性相對最高的是野牦牛、牛和藏羚羊的TLR6基因序列，分別為99.5%、97.7%和96.7%；最低的是地中雀、草原田鼠，為60.4%和77.0%；與綿羊、野豬、狐蝠、人等的同源性都高于80%。該結(jié)果表明，牦牛TLR6基因在長期進(jìn)化中較為保守，尤其在哺乳動物間具有較高保守性。

2.7 遺傳進(jìn)化樹

用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法，重復(fù)1 000次，將獲得的10條TLR6基因序列構(gòu)建Boot?strap驗證的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，牦牛與野牦牛和牛TLR6基因的親緣關(guān)系最近，并與藏羚羊、綿羊等形成哺乳動物的一個分支，然后地中雀形成與牦牛遺傳距離較遠(yuǎn)的分支。

圖5 牦牛TLR6基因的核苷酸序列同源性比較Fig.5 Alignment of TLR6 gene sequences in yak

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線以連續(xù)10倍倍比稀釋（1×102～1×108copies·μL-1）的陽性質(zhì)粒為模板，經(jīng)定量PCR擴(kuò)增后，計算Ct值得出最佳檢測區(qū)域，并制作各基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖7、表3。

圖7 Real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curves of the real-time PCR

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 3 Relative parameters of standard curve

由圖7、表3可知，TLR6和β-actin基因相關(guān)系數(shù)R2＞0.990，說明Ct值與cDNA濃度間具有良好線性關(guān)系；TLR6和β-actin基因擴(kuò)增效率（E）約為1.0，說明擴(kuò)增效率基本相同，以上分析說明建立的熒光定量檢測方法快速、敏感性高、特意強(qiáng)等，可用于△△Ct相對定量的PCR分析。

2.9 熒光定量PCR檢測TLR6基因在牦牛各組織的表達(dá)分布

采用β-actin為參照基因，SYBR Green I為熒光染料，TLR6S、TLR6A、β1-S、β1-A為引物通過熒光定量PCR方法檢測TLR6基因在牦牛各組織的表達(dá)分布。數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后，繪制的TLR6基因各組織相對表達(dá)量如圖8所示。

由圖8可知，TLR6基因在脾臟表達(dá)量最高，在肌肉表達(dá)量最低，在卵巢、肺、腎、肝、小腸、心、大腸等組織依次有較高表達(dá)。

圖8 牦牛TLR6基因組織表達(dá)分布Fig.8 Tissues expression and distribution of TLR6 gene in yak

3 討論與結(jié)論

TLR6作為TLRs重要成員，通過與TLR2相互協(xié)同發(fā)揮作用，在機(jī)體抗感染免疫中起重要作用。目前，國內(nèi)外對于TLR6受體的相關(guān)研究在人、鼠、豬、馬、牛等動物已有報道，但對牦牛及其他高原動物TLR6基因相關(guān)基礎(chǔ)研究尚屬空白[4-10]。近年來牦牛疫病對牦牛產(chǎn)業(yè)危害增大，研究牦牛TLR6分子結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，建立一種檢測牦牛各組織TLRs基因表達(dá)水平的熒光定量方法，了解不同組織器官和細(xì)胞中天然免疫受體TLRs的分布和表達(dá)規(guī)律，對揭示牦牛及高原動物天然免疫機(jī)制和應(yīng)對牦牛及其他高原動物重大疫病防控具有重要意義[11-12]。

3.1 結(jié)構(gòu)和功能

本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對所得序列進(jìn)行分析和預(yù)測，其中TLR6蛋白信號肽預(yù)測顯示，TLR6分子N端具有一段由32個氨基酸組成的信號肽序列，此外S值在第26個氨基酸處變化明顯，Y值峰也較突出，綜合判斷該蛋白可能在此點(diǎn)存在剪切位點(diǎn)。提示該蛋白質(zhì)能夠被分泌到細(xì)胞外，可能作為重要的細(xì)胞因子發(fā)揮作用，具有潛在應(yīng)用價值。TLR6基因編碼產(chǎn)物親/疏水性，預(yù)測結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白以疏水性區(qū)域為主，推測整個蛋白成疏水性。TLR6基因跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白是典型跨膜蛋白，包含兩個跨膜區(qū)域，分別位于氨基酸第12～29位和第589～611位，提示TLR6作為細(xì)胞表面受體，借助膜外結(jié)構(gòu)識別各種刺激信號，通過跨膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，引起胞內(nèi)區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而激發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致胞內(nèi)生理生化反應(yīng)。

3.2 同源性和遺傳進(jìn)化關(guān)系

同源性分析顯示，牦牛TLR6基因與野牦牛、牛和藏羚羊相比同源性相對最高，分別為99.5%、97.7%和96.7%；與綿羊、野豬等哺乳動物同源性也都高于80%。遺傳進(jìn)化關(guān)系表明，牦牛與野牦牛和牛TLR6基因的親緣關(guān)系最近，并與藏羚羊、綿羊、野豬、狐蝠、人、草原田鼠形成哺乳動物的一個分支，與地中雀形成與牦牛遺傳距離較遠(yuǎn)的分支。結(jié)果與動物分類學(xué)觀點(diǎn)一致，說明在近緣物種，尤其在哺乳動物中TLR6具有較高的保守性。牦牛與牛、綿羊等內(nèi)地平原物種相比生活生長環(huán)境惡劣，同等條件下對高寒低氧所致疾病的抵抗能力相對較強(qiáng)，本試驗初衷推測其與其他物種間存在差異性，但試驗結(jié)果顯示TLR6基因與其他物種表現(xiàn)出相當(dāng)高同源性，認(rèn)為TLR6基因高度保守可能與TLRs基因成員僅識別表達(dá)在病原微生物上的高度保守的結(jié)構(gòu)基序（Motifs）病原相關(guān)分子模式（PAMP）有關(guān)[13-14]。此外本研究推測這種差異有可能存在于編碼區(qū)之外的區(qū)域，如啟動子區(qū)域或是由于甲基化等表觀遺傳學(xué)上的差異造成。這對揭示動物傳染病的發(fā)病機(jī)理、多種動物或人共患病的跨物種傳播機(jī)制及抗病育種策略等有重要理論價值。

3.3 熒光定量方法建立及組織表達(dá)分布研究

本試驗采用SYBR Green I熒光染料嵌合法建立檢測牦牛天然免疫受體TLRs家族TLR6和TLR6基因的熒光定量PCR方法。數(shù)據(jù)分析上，本試驗選擇相對定量法，利用內(nèi)參基因β-actin消除mRNA的提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率間的差異，對TLR6 mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果進(jìn)行校正，保證研究結(jié)果可靠性。結(jié)果表明，TLR6基因在脾臟表達(dá)量最高，在肌肉表達(dá)量最低，在卵巢、肺、腎、肝、小腸、心等組織依次有較高表達(dá)。這與Takeuchi等采用RT-PCR技術(shù)分析顯示TLR6主要在鼠的脾臟、胸腺、卵巢及肺臟中表達(dá)研究結(jié)果一致[15]。卵巢皮質(zhì)內(nèi)有豐富的淋巴管互相連接，在髓質(zhì)內(nèi)淋巴毛細(xì)管集合成較大的淋巴管出卵巢門，注入腰淋巴結(jié)。牦牛TLR6基因在脾臟、卵巢、肺、小腸等組織器官中具有高表達(dá)量，說明TLR6在淋巴樣器官高表達(dá)，特別是在富含巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞器官中主要表達(dá)?？芍猅LR6基因在動物機(jī)體抗病免疫過程中發(fā)揮重要作用。可為進(jìn)一步豐富和研究牦牛及其他高原動物抗病性及免疫分子機(jī)制提供有效技術(shù)平臺和理論依據(jù)。不同品種、不同年齡、不同海拔地區(qū)牦牛，TLRs mRNA在各組織器官轉(zhuǎn)錄水平是否存在差異，尚需深入研究。

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Cloning,sequence analysis ofTLR6 gene of yak and expression and distribution in tissues

LIN Baoshan1,LAN Daoliang2,HUANG Cai1,CHEN Yabing1,ZHANG Yan1,WANG Ying3,LI Jian1,2(1.School of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;2.School of Tibetan Plateau Research,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China;3.Animal Disease Prevention and Control Center of Sichuan Province,Chengdu 610041,China)

To understand the characteristics of yakTLR6 gene and the dynamic distribution in various tissues and organs.According toBos mutusTLR6 sequence in GeneBank,The paper designed the cloning and real-time PCR primers.Besides,we successfully established a real-time PCR methods for detecting the expression pattern ofTLR6 gene in yak.The results showed that the length of the cloned cDNA ofTLR6 was 2 397 bp,it encoded a peptide of 798 amino acids whose calculated molecular weight was 91.5719 ku,PI was 6.45.The protein prediction software showed that TLR6 protein performed hydrophobicity.Sequence homology analysis showed that yak had higher homology with Bos mutus,Bos taurus,Pantholops hodgsoniiand other species among the nine sequences,which had the nearest perimeter in the phylogenetic tree. The results of real-time PCR showed thatTLR6 gene was expressed in all the tissues of yak,the highest in the spleen,the lowest in the muscle and followed by the lung,ovary,small intestine and other tissues.The results suggested thatTLR6 gene might play an important role in the immune molecular mechanisms of yak disease.To study the distribution and dynamics expression of TLRs in yaks and other animals in the highland is of significance,and provides a basis for future research on the breeding for disease resistance of yak.

yak;TLR6;cloning;real-time PCR;expression and distribution in tissues

S823.8+5；Q785

A

1005-9369（2014）07-0091-07

時間2014-7-8 13:16:57 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140708.1316.001.html

林寶山,蘭道亮,黃偲,等.牦牛TLR6基因的克隆、序列分析及其表達(dá)分布研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):91-97.

Lin Baoshan,Lan Daoliang,Huang Cai,et al.Cloning,sequence analysis ofTLR6 gene of yak and expression and distribution in tissues[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):91-97.(in Chinese with English abstract)

2014-04-01

中央高校青年教師基金項目（2014NZYQN37）

林寶山（1987-），男，碩士研究生，研究方向為高原動物免疫分子機(jī)制。E-mail:172407151@qq.com

*通訊作者：李鍵，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為動物生殖調(diào)控研究。E-mail:lijian@swun.cn