響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究

王 希，鐘耀廣*，市川壽

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.日本長崎大學(xué)水產(chǎn)學(xué)部，長崎 852-8043，日本）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究

王 希1，鐘耀廣1*，市川壽2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.日本長崎大學(xué)水產(chǎn)學(xué)部，長崎 852-8043，日本）

以冷凍阿拉斯加深海鱈魚皮為原料，利用響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化超聲波快速提取膠原蛋白的工藝。根據(jù)單因素試驗影響因子的分析，選取pH、提取溫度、超聲波提取時間作為響應(yīng)面分析法中的影響因子，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)立建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝：pH 2.0、溫度35℃、超聲波輔助提取時間3.5 h、酶解時間7.5 h，膠原蛋白提取率達(dá)33.75%。

響應(yīng)面；超聲波；膠原蛋白；鱈魚

膠原蛋白是占哺乳動物總蛋白20%～30%的主要結(jié)構(gòu)蛋白[1]。支持和保護(hù)身體各器官，是結(jié)締組織結(jié)構(gòu)蛋白重要主體[2]。膠原分子多肽鏈相互纏繞成一種三螺旋結(jié)構(gòu)[3]。膠原蛋白提取可使用或結(jié)合酸提取、堿提取、鹽萃取、酶法提取、熱水提取法提取[4]。由于傳統(tǒng)單一方法提取時間長、效率低，本文采用超聲波酶解提取法，該方法污染小、時間短，能較完整提取生物活性大分子[5]。

純正鱈魚指鱈屬魚類，分為大西洋鱈魚（Ga?dus morhua）、格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）和太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）[6]。阿拉斯加三面環(huán)海，是全球為數(shù)不多能大量供應(yīng)多種深海魚類的產(chǎn)地[7]。研究利用胃蛋白酶對深海鱈魚皮的作用，制備可溶性膠原蛋白，切去膠原肽鏈端肽的交聯(lián)區(qū)，使酸性pH條件下膠原組織膨脹，溶解[8]。酶解鱈魚皮膠原蛋白具有獨特的保濕性能，抗氧化，減緩皮膚衰老[9]。超聲波可提高提取率，促進(jìn)酶活性，或者破壞酶結(jié)構(gòu)，使酶失活。本研究以阿拉斯加鱈魚魚皮為原料，采用超聲波輔助酶解條件，利用響應(yīng)面分析法分析，為膠原蛋白提取與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

阿拉斯加深海鱈魚皮，購自大連市鴻運魚皮加工廠；胃蛋白酶（1 200 U·g-1），羥脯氨酸，乙二胺四乙酸（EDTA），氯胺T，對二甲基氨基苯甲醛，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純（AR）。

1.2 主要儀器

THZ-82（A）氣浴恒溫振蕩器，購自金壇市科析儀器公司；臺式高速離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外分光光度計，購自上海天美科學(xué)儀器有限公司；超聲波儀，購自上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取膠原蛋白[10]

冷凍阿拉斯加深海鱈魚皮先解凍，浸泡在10倍體積的NaCl溶液中，置于4℃冰箱冷藏2～3 h，去除雜蛋白。取處理后魚皮10 g，加入10 mL乳酸，0.65 mL胃蛋白酶（1 200 U·g-1）和2～3顆玻璃珠，在室溫下放入超聲波（180 W）中提取膠原蛋白，使蛋白酶和魚皮充分反應(yīng)[11]。一定時間后放入恒溫培養(yǎng)箱，恒溫一定時間。所得提取液在離心力560 N（10 000 r·min-1）下高速離心15 min，上層粘性液體加入NaCl至濃度2.5 mol·L-1，2 h后絮狀沉淀，再次以560 N（10 000 r·min-1）高速離心15 min，得到沉淀，置于透析袋中透析，透析內(nèi)外液均設(shè)為蒸餾水，用10%硝酸銀檢驗透析外液無白色沉淀為止，將提取液進(jìn)行冷凍干燥得膠原蛋白成品[12]。為確定膠原蛋白最佳提取工藝，在前期研究基礎(chǔ)上設(shè)計以超聲波提取時間、酶提取時間、酶解溫度、pH為因素的正交試驗。

1.3.2 繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

本文通過測得吸光度值，利用公式計算出膠原蛋白中羥脯氨酸含量，羥脯氨酸為膠原蛋白獨有氨基酸，此方法可計算出膠原含量[13]。

先用0.01 mol·L-1鹽酸溶解100 mg L-羥脯氨酸，加蒸餾水至100 mL以制備羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲存液，并于4℃冷藏貯存。再取儲存液10 mL，倒入100 mL容量瓶加蒸餾水定容，由于溶液常溫光照易分解，需現(xiàn)用現(xiàn)配，把標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為100 mg·L-1，得到羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液[14]。取8支試管，分別加標(biāo)準(zhǔn)工作液從1～4.5 mL每隔0.5 mL，之后加蒸餾水稀釋至100 mL。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，再加入1 mL C6H8O7及1 mL氯胺T溶液，氧化10 min，加HClO4溶液1 mL，靜置10 min后置于65℃水浴鍋顯色反應(yīng)，加入對二甲基氨基苯甲醛顯色劑1 mL，水浴顯色10 min后冷卻，在560 nm處測量吸光度（蒸餾水為空白對照）[15]。羥脯氨酸濃度為x軸，紫外分光光度計測得吸光度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程，見圖1。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of hydroxyproline

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.0501x+0.132，R2=0.999。

式中，x—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）。

1.3.3 鱈魚皮膠原蛋白提取液中羥脯氨酸含量的測定

將1.3.1制備的膠原蛋白提取液加至100 mL容量瓶內(nèi)，再加入蒸餾水定容。取稀釋后1 mL溶液再加入50 mL蒸餾水稀釋。取上述溶液1 mL置于試管內(nèi)，加入檸檬酸緩沖液1 mL，氯胺T 1 mL，混合氧化10 min，之后加入HClO4溶液1 mL，靜置10 min。利用顯色劑在65℃水浴鍋顯色反應(yīng)，上述稀釋溶液中加入對二甲基氨基苯甲醛顯色試劑1 mL，顯色10 min，靜置冷卻。利用紫外分光光度儀在560 nm處測量吸光度（蒸餾水為空白對照）[16]。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品液中羥脯氨酸質(zhì)量濃度，再用公式得到羥脯氨酸得率：

式中，W—樣品中羥脯氨酸得率（%）；ρ—羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V—提取液總體積（mL）；k—稀釋倍數(shù)；m—原料質(zhì)量（g）；n—換算系數(shù)（為0.1）。

成品得率（%）=冷凍干燥后膠原蛋白重量（g）/魚皮原重量（g）×100%°

1.3.4 單因素試驗

通過預(yù)試驗設(shè)定選取超聲波提取時間、胃蛋白酶提取時間、酶解溫度、pH 4個單因素水平。在pH 2.0、酶解溫度35℃、酶解提取時間7.5 h條件下，選取超聲波時間為2、2.5、3.0、3.5、4、4.5 h，測定并計算膠原蛋白提取率；在pH 2.0、酶解溫度35℃、超聲波提取時間3.5 h條件下，選取提取時間4、5、6、7、8、9 h，測定提取率；在超聲波提取時間3.5 h、酶解時間7.5 h、pH 2.0條件下，選取胃蛋白酶水解溫度25、30、35、40、45℃進(jìn)行單因素試驗測定提取率；在超聲波提取時間3.5 h、酶解時間為7.5 h、提取溫度35℃條件下，pH分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0進(jìn)行提取試驗。每個水平平行3次取平均值。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取超聲波提取時間、酶解溫度、pH 3個因素為參考因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計3因素3水平試驗（見表1），采用Design expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，得到提取膠原蛋白的優(yōu)化工藝。

表1 Box-Behnken試驗3因素水平編碼Table 1 Codes and levels on three factors of Box-Behnken experimental

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Excel 2007、Design expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波提取時間對膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨超聲波提取時間延長，提取率不斷增大，說明超聲波可增加提取率，縮短提取時間，但當(dāng)超聲波提取時間超過3.5 h后，提取率不變，說明膠原蛋白與胃蛋白酶間傳質(zhì)推動力趨于零。

圖2 超聲波提取時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of supersonic extraction time on extraction rate of collagen

2.1.2 胃蛋白酶水解時間對膠原蛋白提取率的影響

結(jié)果見圖3，酶解時間7.5 h最佳，繼續(xù)增加酶量，得率增加緩慢，不適宜增加更高酶量。

圖3 胃蛋白酶水解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of enzymatic time on extraction rate of collagen

2.1.3 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響

選取不同溫度條件下，探討溫度對膠原蛋白酶解提取效果的影響。結(jié)果見圖4，隨溫度提高，提取率不斷上升，在35℃時達(dá)最大，溫度繼續(xù)升高則提取率下降，說明酶活性被高溫抑制。結(jié)果說明，35℃是胃蛋白酶適宜溫度，其活性達(dá)最大。

圖4 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of collagen

2.1.4 pH對膠原蛋白提取率的影響

調(diào)節(jié)不同pH測定對膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖5所示，在pH 2.0時提取率最佳，同時也適合胃蛋白酶的活性酸度范圍。

圖5 pH對膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of pH on extraction rate of collagen

2.1.5 優(yōu)化正交試驗

上述單因素試驗可得出，膠原蛋白提取率與胃蛋白酶解時間關(guān)系較不明顯，與超聲波提取時間、pH、溫度關(guān)系影響較大。取超聲波提取時間、pH、提取溫度為影響因素，確定胃蛋白酶解時間7.5 h，每個因素取3個水平，設(shè)計L9（33）正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件[17]。每組試驗取10 mL膠原蛋白提取液，各組試驗提取液按1.3.2方法測定吸光度，計算膠原蛋白提取率。結(jié)果見表2。

按照正交試驗所得結(jié)果，分析3個因素水平對提取率影響程度分別為：超聲提取時間＞pH＞溫度；經(jīng)分析結(jié)果得出膠原蛋白提取最優(yōu)工藝A2C2B2，即pH 2.0、溫度35℃、超聲波提取時間3.5 h。

表2 L9(33)正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of L9(33)'s orthogonal experiment

2.1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計方案，選取超聲波提取時間（X1）、酶解溫度（X2）、pH（X3）3個影響因子，膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，可得到試驗設(shè)計結(jié)果見表3。

表3 膠原蛋白提取工藝Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken design and corresponding for collagen extraction

采用Design expert 8.0.6軟件對17組試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項擬合回歸分析，可以得到pH、超聲波提取時間及酶解溫度對提取率影響的多元二次回歸方程：

檢驗回歸方程有效性及3個單因素因子對鱈魚皮中膠原蛋白提取率的影響，對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析（見表4）。P＜0.0001表示有極顯著的差異，0.0001＜P＜0.01較為顯著差異，0.01＜P＜0.05有顯著差異。P值為0.1183不顯著，決定系數(shù)R2= 0.9875，表明超聲波提取時間、酶解溫度及pH等3個因子對鱈魚皮膠原蛋白提取率有98.75%影響?？梢钥闯?，此模型擬合度較適合分析鱈魚蛋白提取率，回歸方程可以表示3因素對響應(yīng)值函數(shù)關(guān)系。

由表4可知，回歸模型中X2的P＜0.0001，表明酶解溫度（X2）對膠原蛋白的提取率影響極其顯著。pH（X3）P值為0.0001～0.01，其對鱈魚蛋白提取率影響較為顯著。超聲波提取時間（X1）的P＞0.01也說明其顯著影響蛋白提取率，不如pH及酶解溫度影響明顯。X1X3和X2X3項對響應(yīng)值有顯著影響，而X1X2沒有。二次項3個因素顯著性X22＞X32＞X12。顯示3個因子超聲波提取時間、酶解溫度、pH對鱈魚皮膠原蛋白提取影響相關(guān)聯(lián)，不是單因素影響的線性關(guān)系，通過數(shù)學(xué)建模可表示3因素對提取率的影響。

表4 提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for the regression equation describing the extraction process

由響應(yīng)面圖6～8可知，3個因子對響應(yīng)值的敏感程度，酶解溫度響應(yīng)曲面最陡峭，對蛋白提取率作用最顯著，其次是pH，再次是超聲波提取時間。通過使用軟件Design expert 8.0.6對回歸方程進(jìn)行計算，進(jìn)而得到最優(yōu)工藝：在酶解時間7.5 h條件下，超聲波輔助提取時間3.5 h，pH 2.0，溫度35℃，膠原蛋白的模型最優(yōu)提取率達(dá)33.28%。利用數(shù)學(xué)建模得出模型條件，進(jìn)行3次平行試驗，所得蛋白提取率為33.75%，與預(yù)測模型相差不大。實際試驗操作結(jié)果與數(shù)學(xué)模型結(jié)果一致，說明擬合度良好，可以響應(yīng)面優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)得出工藝參數(shù)。

2.2 提取膠原蛋白純度測定

經(jīng)冷凍干燥后的膠原蛋白為淺黃色三維孔狀結(jié)構(gòu)，是一種含大量羥基的糖蛋白，通過氫鍵可與水分子結(jié)合，吸水性極強(qiáng)[18]。

取10 mg冷凍干燥后的膠原蛋白樣品，加入20 mL濃度為6 mol·L-1鹽酸溶解，測定特征氨基酸羥脯氨酸質(zhì)量濃度，3次平行試驗取平均值，計算膠原蛋白提取率（%）=干燥后膠原質(zhì)量（mg）/干燥前膠原質(zhì)量（mg）×100%=33.75%。

圖6 pH 2.0時超聲波提取時間和溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of supersonic extraction time and temperature on extraction rate of collagen with pH 2.0

圖7 超聲波提取時間3.5 h時pH和溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on extraction rate of collagen with supersonic extraction time 3.5 h

圖8 溫度為35℃時超聲波提取時間和pH對膠原蛋白提取率的影響Fig.8 Effects of supersonic extraction time and pH on extraction rate of collagen with temperature 35℃

2.3 膠原蛋白光譜掃描

取適量稀醋酸溶解少量膠原蛋白提取液，置于紫外分光光度計中，以稀醋酸作為空白對照，在近紫外區(qū)200～300 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，在近紫外區(qū)200～300 nm進(jìn)行光譜掃描，其最大特征吸收波長為226 nm，符合膠原蛋白紫外吸收特征[19]。

圖9 膠原蛋白的紫外光譜Fig.9 UV absorption spectrum of collagen

3 討論與結(jié)論

目前對膠原蛋白提取液進(jìn)行鹽析、透析多采用提取試劑溶解經(jīng)NaCl鹽析成的絮狀沉淀，透析外液也用提取試劑進(jìn)行透析，本試驗用蒸餾水作為溶解液和透析外液，節(jié)約成本。在提取時加入少量玻璃珠于提取試劑中，加速塊狀魚皮溶解速度。

超聲波產(chǎn)生微聲流能加快傳質(zhì)擴(kuò)散，產(chǎn)生空化、震蕩效應(yīng)，活化酶分子構(gòu)象及催化部位。本試驗利用超聲波和胃蛋白酶共同作用提取膠原蛋白，所用時間為3.5 h，與單獨酶解所需時間23 h相比，能夠顯著縮短提取時間。

本研究將響應(yīng)曲面法運用于優(yōu)化鱈魚皮膠原蛋白提取工藝。經(jīng)試驗優(yōu)化后的膠原蛋白提取最佳工藝條件為：超聲波輔助提取時間3.5 h、pH 2.0、溫度35℃、酶解時間7.5 h。此工藝下建模理論提取率為33.28%，實際試驗得出提取率為33.75%，誤差小。因此，可采用此模型對試驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各因素對膠原蛋白提取率的影響分別為：超聲波輔助提取時間＞pH＞溫度＞酶解時間。研究結(jié)果顯示，超聲波輔助酶法提取膠原蛋白時間短、得率高。如何將多種提取方法結(jié)合使用最大限度縮短提取時間并提高得率，尚待深入研究。

[1]安鋒利,王建林,權(quán)美平,等.膠原蛋白的應(yīng)用及其發(fā)展前景[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(1):8-11.

[2]李二鳳,何小維,羅志剛.膠原蛋白在食品中的應(yīng)用[J].中國乳品工業(yè),2006(2):50-52.

[3]劉?,劉玲蓉,陳名懋,等.膠原模擬多肽三螺旋結(jié)構(gòu)的熱變性過程[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2010(3):343-346.

[4] 張彥民,李寶才,朱利平,等.多糖化學(xué)及其生物活性研究進(jìn)展[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報:理工版,2003(3):140-145,149.

[5]喬振峰.表面活性劑在提取中草藥活性成分中的應(yīng)用[D].蘭州:蘭州大學(xué),2009.

[6]Swatschek D,Schatton W,Kellermann J,et al.Marine sponge col? lagen:Isolation,characterization and effects on the skin parame?ters surface-pH,moisture and sebum[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2002,53(1):107-113.

[7]Cho S M,Gu Y S,Kim S B.Extracting optimization and physical properties of yellowfin tuna(Thunnus albacares)skin gelatin com?pared to mammalian gelatins[J].Food Hydrocolloids,2005,19: 221-229.

[8]林琳.魚皮膠原蛋白的制備及膠原蛋白多肽活性的研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2006.

[9]Amesen J A,Gildberg A.Extraction and characterization of gela?tine from Atlanticsalmon(Salmo salar)skin[J].Bioresource Tech?nology,2007,98:53-57.

[10]Sadowska M,Kolodziejska I,Niecikowska C.Isolation of collagen from the skins of Baltic cod(Gadus morhua)[J].Food Chemistry, 2003(81):257-262.

[11]閆鳴艷.狹鱈魚皮膠原蛋白結(jié)構(gòu)和物理特性的研究[J].青島:中國海洋大學(xué),2009:17-42.

[12]程波,戶業(yè)麗,呂中,等.人工養(yǎng)殖鱘魚鰭中膠原蛋白含量的測定[J].中國食品添加劑,2008(4):126-129.

[13]Jongjareonrak A,Benjakul S,Visessanguan W,et al.Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of Brown stripe red snapper(Lutjanus vitta)[J]. Food Chemistry,2005,93:475-484.

[14]Skierka E,Sadowska M.The influence of different acids and pep?sin on the extractability of collagen from the skin of Baltic cod (Gadus morhua)[J].Food Chemistry,2007(105):1302-1306.

[15]Sadowska M,Ko?odziejska I.Optimisation of conditions for precip?itation of collagen from solution using κ-carrageenan.Studies on collagen from the skin of Baltic cod(Gadus morhua)[J].Food Chemistry,2005(91):45-49.

[16]張俊杰,曾慶孝.比色法測定魚鱗中羥脯氨酸的研究[J].食品科技,2004(4):83-85.

[17]劉瑞江,張業(yè)旺,聞崇煒,等.正交試驗設(shè)計和分析方法研究[J].實驗技術(shù)與管理,2010(9):52-55.

[18]李鑫.真空冷凍干燥技術(shù)及其制冷系統(tǒng)節(jié)能的實驗研究[D].北京:北京工業(yè)大學(xué),2012.

[19]呂婷,王紅英,孫佳佳,等.酶法制取魚皮膠原蛋白短肽[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,28(1):9-12.

Optimization of cod skin collagen extrating conditions by ultrasonic respose surface methodology

WANG Xi1,ZHONG Yaoguang1,ICHIKAWA Hisashi2(1. School of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2. Faculty of Fisheries,Nagasaki University,Nagasaki 852-8043,Japan)

Using fresh Alaska abysmal sea cod skin as raw material,the use of response surface methodology(RSM)optimized the ultrasonic extraction of collagen fast process.It could get the factor order by using single factor experiment.pH,temperature and the supersonic extraction time were chosen as influencing factors.The extraction rate of collagen was selected as response value.The mathematical model was established by Box-Behnken central composite design.The results showed that the optimum conditions were pH 2.0,temperature 35℃,supersonic extraction time 3.5 h,the decomposition time of enzyme 7.5 h, extraction rate of collagen was 33.75%.

response surface;ultrasonic wave;collagen;cod

TS254.9；S965.321

A

1005-9369（2014）07-0117-07

時間2014-7-4 17:27:09 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.011.html

王希,鐘耀廣,市川壽.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波快速提取鱈魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):117-123.

Wang Xi,Zhong Yaoguang,Ichikawa Hisashi.Optimization of cod skin collagen extrating conditions by ultrasonic respose surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):117-123.(in Chinese with English abstract)

2014-04-13

上海市科委工程中心建設(shè)項目（11DZ2280300）

王希（1987-），女，碩士研究生，研究方向為功能食品。E-mail:195184808@qq.com

*通訊作者：鐘耀廣，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為食品安全與功能食品。E-mail：ygzhong@shou.edu.cn