蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙奎軍，邢亞楠，韓嵐嵐，孫文鵬，張紅玉，李 冉，韓曉旭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙奎軍1，邢亞楠1，韓嵐嵐1，孫文鵬2，張紅玉1，李 冉1，韓曉旭1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）Bt20菌株為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治實(shí)驗(yàn)室分離出來(lái)的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的菌株，其對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)殺蟲(chóng)活性，具有良好推廣應(yīng)用價(jià)值。文章進(jìn)行優(yōu)化Bt20菌株的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源材料研究，試驗(yàn)以Bt20菌株發(fā)酵液吸光度值及對(duì)2齡小菜蛾的毒力效果為指標(biāo)，首先采用單因素試驗(yàn)對(duì)Bt20菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源及氮源進(jìn)行優(yōu)化，篩選得到最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為蠅蛆、酵母粉、魚(yú)粉、大豆粉；運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)優(yōu)化后的碳、氮源進(jìn)行正交試驗(yàn)，明確Bt20菌株最佳液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米粉3.0%、蠅蛆3.0%、大豆粉3.0%、酵母粉2.0%；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基下，Bt20發(fā)酵液吸光度值為1.4733，發(fā)酵液處理2齡小菜蛾，3 d后校正死亡率為98.31%，顯著優(yōu)于魚(yú)粉發(fā)酵液的吸光度值1.0683及校正死亡率88.14%，提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量和毒力，降低生產(chǎn)成本，可為Bt20商品化及大規(guī)模應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

蘇云金芽胞桿菌Bt20；發(fā)酵條件優(yōu)化；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上產(chǎn)量和使用量最大的微生物殺蟲(chóng)劑，已有200多種商品制劑，占整個(gè)生物殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)53%的份額，每年約產(chǎn)生120～140億美元稅收，在農(nóng)林害蟲(chóng)防治中應(yīng)用廣泛，發(fā)展前景廣闊[1-2]。近年來(lái)，有許多新的Bt菌株不斷被發(fā)掘，但應(yīng)用到生產(chǎn)中，還要經(jīng)歷助劑、復(fù)配、發(fā)酵等研發(fā)過(guò)程。

高效培養(yǎng)基的篩選對(duì)Bt工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要。Stanbury等估測(cè)生產(chǎn)Bt殺蟲(chóng)劑所需原材料成本占整個(gè)生產(chǎn)成本35%～59%[3]。因此，找到能使蘇云金芽胞桿菌高產(chǎn)并降低生產(chǎn)成本的發(fā)酵原材料是規(guī)?；唐坊a(chǎn)的基礎(chǔ)[4]。研究表明，Bt對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不嚴(yán)，在含氮量0.075%～0.225%、含糖量0.1%～1.5%、糖氮比0.44～20.0營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好[5]。國(guó)際上常用魚(yú)粉、大豆粉、昆蟲(chóng)蛹、復(fù)雜的工農(nóng)業(yè)廢物（木薯淀粉，玉米淀粉，稻草，麥麩，玉米漿酒，甘蔗糖蜜，干酪乳清和椰子廢物等）[6-11]及工業(yè)廢水、污泥[12-13]代替高成本發(fā)酵介質(zhì)，降低Bt殺蟲(chóng)劑生產(chǎn)成本。

雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)Bt發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究有諸多報(bào)道，發(fā)酵技術(shù)相當(dāng)成熟，但對(duì)于不同的Bt菌株其最適發(fā)酵培養(yǎng)基及條件不同[5]。本研究主要采用單因素及正交試驗(yàn)，以發(fā)酵液吸光度值及殺蟲(chóng)毒力為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立分離的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有高毒力的蘇云金芽胞桿菌Bt20（以下簡(jiǎn)稱Bt20）菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌株產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；瘧?yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供式菌株

蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治實(shí)驗(yàn)室保留菌株，中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏（保藏號(hào)：GMCCNO，1710）。經(jīng)前期工作篩選得到的對(duì)十字花科蔬菜危害嚴(yán)重的鱗翅目害蟲(chóng)有較高毒力。

1.2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，定容至1 L，pH 8.0的Tris-HCl調(diào)節(jié)pH 7.2，滅菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 活化菌種的制備

挑取在LB固體培養(yǎng)基活化的菌種Bt20，一菌環(huán)接種到5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃恒溫，230 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后，以1%接種量再轉(zhuǎn) 接到新的5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，二次活化，準(zhǔn)備接種。

1.4 碳源篩選

以2.0%蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源，0.03% K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02% ZnSO4作為培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽，固定氮源及無(wú)機(jī)鹽不變，再分別以2.0%玉米粉、玉米淀粉作為碳源，篩選不同碳源對(duì)Bt20菌株發(fā)酵的影響。

1.5 氮源篩選

以2.0%玉米粉作培養(yǎng)基碳源，0.03%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.04%CaCO3，0.02%ZnSO4作為培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽，固定碳源及無(wú)機(jī)鹽不變，再分別以2.0%大豆粉、魚(yú)粉、蠅蛆、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨為氮源，篩選不同氮源對(duì)Bt20菌株發(fā)酵的影響。

1.6 碳氮源正交培養(yǎng)基篩選

基于碳、氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出以玉米粉作為唯一碳源，大豆粉、魚(yú)粉、蠅蛆、酵母粉作為氮源的4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，采用L18（37）正交表進(jìn)行氮源比較分析試驗(yàn)（見(jiàn)表1），隨機(jī)安排因素和濃度水平[14]。

1.7 培養(yǎng)方法

按各配方配制培養(yǎng)基50 mL，裝入250 mL三角瓶中滅菌，將在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化的Bt20按1%量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、230 r·min-1發(fā)酵振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵至芽胞晶體形成并有30%以上胞晶分離時(shí)終止，每個(gè)處理3次重復(fù)。

表1 Bt20菌株碳氮源正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental factors and levels design of strain Bt20 carbon and nitrogen sources（%）

1.8 吸光度測(cè)定方法

以未發(fā)酵（空白）培養(yǎng)基作為對(duì)照，每隔4 h，吸取發(fā)酵培養(yǎng)液100 μL，加2 900 μL滅菌蒸餾水，稀釋30倍，分別測(cè)定各個(gè)配方培養(yǎng)液吸光度值OD600，依此繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

1.9 生物活性測(cè)定

采用葉片浸漬法，測(cè)定Bt20菌株各配方發(fā)酵液對(duì)小菜蛾2齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)效果。將各配方發(fā)酵液分別稀釋100、200、400、800、1 600、3 200倍，將無(wú)菌新鮮的白菜葉片剪成7 cm圓片，浸泡在稀釋好的發(fā)酵液中10 s，取出自然晾干，然后放入培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度接入20頭健康、大小一致的2齡小菜蛾幼蟲(chóng)，重復(fù)3次，以加清水處理為空白對(duì)照，置于24～26℃，相對(duì)濕度60%～70%人工氣候箱中，飼養(yǎng)72 h后，調(diào)查存活死亡情況，計(jì)算LC50[15]。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和DPSv7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)Bt20發(fā)酵液OD值的影響

以2.0%蛋白胨作為氮源，圖1表明，不同碳源對(duì)Bt20整個(gè)發(fā)酵過(guò)程OD值的影響：0～8 h玉米淀粉對(duì)發(fā)酵液OD值的影響優(yōu)于玉米粉。但8 h至整個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束，玉米粉對(duì)發(fā)酵液OD值的影響要高于玉米淀粉。

圖2表明，在P＜0.01水平下，振蕩培養(yǎng)40 h時(shí)，以玉米粉為主要碳源的Bt20發(fā)酵液最大吸光度值為0.729，極顯著優(yōu)于振蕩培養(yǎng)44 h時(shí)以玉米淀粉為碳源的發(fā)酵液最大吸光度值0.679。總體來(lái)看，Bt20對(duì)碳源的利用效率為，玉米粉優(yōu)于玉米淀粉。

圖1 不同碳源對(duì)Bt20菌株發(fā)酵過(guò)程吸光度值的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the absorbance values in strain Bt20 fermentation process

圖2 不同碳源對(duì)Bt20菌株最大吸光度值的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

2.2 不同氮源對(duì)Bt20發(fā)酵液OD值的影響

以2.0%玉米粉為碳源，針對(duì)氮源進(jìn)行篩選的結(jié)果表明（見(jiàn)圖3、4）。Bt20對(duì)不同氮源的利用情況不同，其主要是利用有機(jī)氮源。圖4表明，對(duì)蠅蛆的利用效率最高，在P＜0.01水平下，極顯著優(yōu)于其他氮源，其最大吸光度值為0.654，較最低的硫酸銨高出兩倍，其次是酵母粉、魚(yú)粉OD值分別為0.623、0.582。雖然蛋白胨和大豆粉最大吸光度值存在極顯著差異，但從整個(gè)生長(zhǎng)周期看（見(jiàn)圖3），蛋白胨最佳產(chǎn)胞時(shí)間為48 h，遠(yuǎn)長(zhǎng)于大豆粉最佳產(chǎn)胞時(shí)間36 h。，從發(fā)酵生產(chǎn)成本看，蛋白胨價(jià)格是大豆粉的8倍。從生產(chǎn)應(yīng)用角度選擇大豆粉作為Bt20發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。被利用效率最低的是硫酸銨，為無(wú)機(jī)氮源，以其作氮源在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中Bt20不產(chǎn)生芽胞及伴胞晶體。綜合分析，Bt20對(duì)氮源利用效率從高到低依次為：蠅蛆＞酵母粉＞魚(yú)粉＞大豆粉＞蛋白胨＞硫酸銨。

2.3 Bt20發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源優(yōu)化正交試驗(yàn)分析

Bt20碳源、氮源優(yōu)化正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表2。

將Bt20碳源、氮源優(yōu)化正交試驗(yàn)吸光度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行分析，結(jié)果表明：玉米粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源時(shí)，其1水平（3.0%）的OD值＞2水平（2.5%）OD值＞3水平（2.0%）OD值，即玉米粉含量與發(fā)酵液OD值在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，說(shuō)明碳源是Bt20生長(zhǎng)發(fā)育的必需因素。因此，選擇1水平（含3.0%）玉米粉。

蠅蛆作為發(fā)酵培養(yǎng)的主要氮源，含豐富氨基酸，在其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1.5%、3.0%時(shí)，發(fā)酵液吸光度值分別為0.7173、0.7383、0.8878。說(shuō)明其含量變化影響B(tài)t20發(fā)酵液的OD值，具有極顯著促進(jìn)作用。由表3極差分析可知，蠅蛆極差R′= 0.2172，明顯高于其他材料提供的氮源極差，這說(shuō)明蠅蛆是這幾種材料中氮源利用效率最高的材料，因此選3水平（含量3.0%）。

同理，由極差分析可知，其他各因素對(duì)Bt20發(fā)酵液的吸光度值影響從高到低依次為：E酵母粉＞A×B＞B魚(yú)粉＞D大豆粉＞A×C。其中，酵母粉3水平＞1水平＞2水平，選3水平（2.0%）；魚(yú)粉1水平＞3水平＞2水平，應(yīng)選1水平，但是A×B互作對(duì)發(fā)酵吸光度值的影響比魚(yú)粉的影響要大，互作中3水平＞1水平＞2水平，因此魚(yú)粉應(yīng)選3水平（0），表明在該培養(yǎng)基配方組合中魚(yú)粉對(duì)該發(fā)酵液OD值影響不大；而大豆粉3水平＞2水平＞1水平，應(yīng)選3水平（3.0%）。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，Bt20最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基組合：A1B3C3D3E3即配方3玉米粉3.0%，蠅蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。

圖3 不同氮源對(duì)Bt20菌株發(fā)酵過(guò)程吸光度值的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the absorbance value in strain Bt20 fermentation process

圖4 不同氮源對(duì)Bt20菌株最大吸光度值的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the maximum absorbance value of strain Bt20

表2 Bt20菌株正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results of strain Bt20

表3 Bt20菌株正交試驗(yàn)極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment of strain Bt20

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)Bt20菌株發(fā)酵毒力的影響

Bt20菌株在18種不同發(fā)酵配方下振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵液對(duì)2齡小菜蛾的殺蟲(chóng)效果如表4所示，Bt20不同配方振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵液即使在較高稀釋倍數(shù)時(shí)也對(duì)2齡小菜蛾有較高殺蟲(chóng)活性，如Bt20菌株在配方1、2、3、4、6振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵液，即使在1 600倍的較高稀釋倍數(shù)下，對(duì)小菜蛾校正死亡率在72 h仍達(dá)65%以上，尤其是配方3的校正死亡率可達(dá)85%。在P＜0.05水平時(shí)，配方3 的100、200、400倍發(fā)酵液稀釋液對(duì)小菜蛾的校正死亡率均達(dá)最高水平，且差異不顯著，結(jié)果表明，Bt20菌株在配方3培養(yǎng)基中所產(chǎn)發(fā)酵液對(duì)2齡小菜蛾的殺蟲(chóng)效果為18種配方中最高。

由表4可知，Bt20菌株在配方3培養(yǎng)基中產(chǎn)生發(fā)酵液對(duì)2齡小菜蛾的LC50為2.11×104cfu·mL-1，其次是配方4所產(chǎn)的發(fā)酵液對(duì)2齡小菜蛾的LC50為2.45×104cfu·mL-1，而配方18和16的發(fā)酵液毒力最差，其LC50分別為1.62×106和1.48×106cfu·mL-1，配方3、4的毒力約是配方18和16的60～77倍，也顯著優(yōu)于其他配方組合。因此，在配方3發(fā)酵培養(yǎng)基下產(chǎn)生的Bt20發(fā)酵液對(duì)2齡小菜蛾殺蟲(chóng)活性最強(qiáng)。該結(jié)果與菌株發(fā)酵液OD值統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致。

表4 Bt20碳氮源正交組合對(duì)小菜蛾殺蟲(chóng)活性測(cè)定Table 4 Insecticidal activity of carbon and nitrogen source orthogonal combination of strain Bt20 against Plutella xylostella

續(xù)表4

4 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Bt20菌株發(fā)酵最優(yōu)配方為A1B3C3D3E3，即配方3：玉米粉3.0%，蠅蛆3.0%，大豆粉3.0%，酵母粉2.0%。經(jīng)正交試驗(yàn)極差分析得出，Bt20對(duì)作為碳源的玉米粉及作為氮源的蠅蛆利用效率明顯高于其他材料，相應(yīng)對(duì)小菜蛾毒力也優(yōu)于其他發(fā)酵培養(yǎng)基配方；Bt20對(duì)同樣作為氮源魚(yú)粉利用效率卻不高，如發(fā)酵配方1（不含有蠅蛆）發(fā)酵液OD值為1.0683，是最優(yōu)配方3（不含魚(yú)粉）OD值1.4433的7/10倍，配方1的LC50為4.37× 104cfu·mL-1是配方3的LC50為2.11×104cfu·mL-1的2倍；對(duì)小菜蛾毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，配方3稀釋3 200倍發(fā)酵液在72 h校正死亡率為84.74%，而配方1稀釋3 200倍的發(fā)酵液在72 h的校正死亡率僅為62.74%，殺蟲(chóng)毒力明顯比配方3低。這可能是由于蠅蛆自身蛋白質(zhì)含量、各氨基酸比例及所含礦物質(zhì)更適合被Bt20菌株利用，為Bt20菌株發(fā)酵培養(yǎng)基提供充足氮源。研究者為降低成本、減少浪費(fèi)，對(duì)Bt發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行大量研究，目前有利用農(nóng)業(yè)廢棄物、工業(yè)廢水污泥等培養(yǎng)Bt，如：用雞糞上清液、淀粉廠廢水[16]、大豆粉+海水[17]等為原料培養(yǎng)Bt，其產(chǎn)胞量分別為2.46×108、2.90× 108、5.20×108cfu·mL-1，本配方產(chǎn)胞量為5.92×108cfu·mL-1，說(shuō)明蠅蛆相比于廢水等能更有效被Bt利用。

陳在佴等研究表明，對(duì)蘇云金桿菌99-11菌株發(fā)酵影響最顯著的是碳源（玉米淀粉），其次是氮源（酵母粉）影響[18]；吳繼星等研究各因素對(duì)蘇云金桿菌79007菌株發(fā)酵影響順序?yàn)椋浩咸烟牵咎砑觿居衩诐{＞淀粉＞豆餅粉＞蛋白胨＞酵母粉，其中碳源（葡萄糖）的影響最大[19]；高鶴永等利用正交法優(yōu)化Bt發(fā)酵培養(yǎng)基，得到影響發(fā)酵主要因素為碳源（玉米粉）＞氮源（豆餅粉）＞氮源（花生餅粉）[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)Bt20對(duì)作為碳源的玉米粉利用效率高于氮源，但與袁志明等研究中氮源對(duì)Bt發(fā)酵菌數(shù)影響要優(yōu)于碳源結(jié)果[21-22]不一致。這說(shuō)明不同蘇云金桿菌亞種對(duì)不同類型碳源和氮源利用能力不一樣[5]；不同來(lái)源的同種原料，其營(yíng)養(yǎng)成分及配比均不同，對(duì)Bt菌株發(fā)酵有影響[23]。

從發(fā)酵成本上看，由于魚(yú)粉是傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)蛋白，被廣泛應(yīng)用于Bt發(fā)酵原材料中，但價(jià)格昂貴，約為10 300～10 400元·t-1，使用受限。而本試驗(yàn)表明Bt20對(duì)蠅蛆利用效率明顯高于魚(yú)粉，價(jià)格低廉約5 000～7 500元·t-1，是魚(yú)粉價(jià)格1/2～7/10倍，即生產(chǎn)每升Bt發(fā)酵液，需要0.84元，其綜合成本低于以魚(yú)粉為氮源的配方，更利于應(yīng)用推廣。

從發(fā)酵時(shí)間上看，本研究?jī)?yōu)化配方發(fā)酵時(shí)間76 h，較一般Bt發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)（48 h）[24]，說(shuō)明該配方營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，使Bt20菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，仍能獲得滿足其生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，繼續(xù)積累Bt20的菌體數(shù)量，提高其產(chǎn)量[25]。

從發(fā)酵機(jī)制上看，本研究?jī)H是在室內(nèi)搖瓶條件下對(duì)Bt20的配方進(jìn)行優(yōu)化，與實(shí)際發(fā)酵罐生產(chǎn)存在一定差別。①本研究實(shí)通過(guò)添加Tris-HCl緩沖液及CaCO3對(duì)發(fā)酵液的初始pH進(jìn)行控制，相比于發(fā)酵罐，無(wú)法實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中pH變化，無(wú)法確保發(fā)酵進(jìn)程順利進(jìn)行。②本研究采用一次性投料發(fā)酵，底物濃度較高，會(huì)抑制發(fā)酵進(jìn)程，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)酵罐采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式避免過(guò)多底物對(duì)發(fā)酵過(guò)程抑制，能縮短發(fā)酵時(shí)間。③本研究搖瓶培養(yǎng)溶氧量較發(fā)酵罐機(jī)械攪拌溶氧量低，而B(niǎo)t是好氧型微生物，發(fā)酵罐效果更好[26]。本研究中所得配方為利用發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，可利用發(fā)酵罐的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)該配方的原材料配比、pH變化、通氣量進(jìn)一步優(yōu)化，為Bt規(guī)模化商品化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20

ZHAO Kuijun1,XING Yanan1,HAN Lanlan1,SUN Wenpeng2,ZHANG Hongyu1,LI Ran1,HAN Xiaoxu1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2. HeilongjiangAgriculture Vocational and Techical College,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

Bacillus thuringiensisstrain Bt20 isolated in our laboratory with independent intellectual property right,had a high insecticidal activity that lepidopteran larvae and possess better popularization and application value.In this paper,we studied that how to optimize the carbon source and nitrogen source materials of Bt20 strain liquid fermentation medium,with the strain Bt20 fermentation broth absorbance value and the virulence against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostellaas indices.Firstly,the single factor tests was performed to optimize the carbon source and nitrogen source materials of strain Bt20 liquid fermentation medium,the obtained optimal carbon source material and nitrogen source materials were the corn flour and the maggot,yeast flour,fish meal,soybean flour,respectively.Secondly,the orthogonal test was performed to the optimal carbon and nitrogen source materials.Experimental results showed that the appropriate formula of liquid fermentation medium was 3.0%corn flour,3.0%maggot,3.0%soybean flour and 2.0% yeast flour.Absorbance value of the optimal fermentation medium was 1.4733 and corrected mortality was 98.31%against the 2nd instar larvae ofPlutella xylostella,after 3 d.The optimal fermentation medium wassignificantly better than the fish meal fermentation broth which the absorbance value was 1.0683 and corrected mortality was 88.14%.The optimized formula can improve the yield and virulence of fermentation products,reduce production costs,and provide fundamental basis for the commercialization and large-scale application of Bt20.

Bacillus thuringensisBt20;fermentation condition optimization;optimal fermentation medium

S476

A

1005-9369（2014）07-0045-09

時(shí)間2014-7-4 17:18:00 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.007.html

趙奎軍,邢亞楠,韓嵐嵐,等.蘇云金芽胞桿菌Bt20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(7):45-53.

Zhao Kuijun,Xing Yanan,Han Lanlan,et al.Optimization of fermentation conditions forBacillus thuringiensisstrain Bt20[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):45-53.(in Chinese with English abstract)

2014-01-13

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-04）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項(xiàng)資助（201103002）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201210224002）

趙奎軍（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治。E-mail：kjzhao@163.com