藍(lán)靛果忍冬分化培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選

李富恒,曲 迪，趙恒田，朱會杰，楊洪升，徐清華，李楠丁

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081）

藍(lán)靛果忍冬分化培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選

李富恒1,曲 迪1，趙恒田2，朱會杰1，楊洪升1，徐清華1，李楠丁1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081）

以藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品系L1-8為試驗(yàn)材料，取其休眠枝條萌發(fā)的腋芽為外植體，將培養(yǎng)基（MS、White、WPM、A3）、激素IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1）、6-BA（1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1）和GA3（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）等處理組合進(jìn)行4因素、4水平的正交試驗(yàn)，以優(yōu)化篩選最佳分化培養(yǎng)基，為完善藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)提供技術(shù)支撐。結(jié)果表明，篩選出最優(yōu)分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA31.5 mg·L-1（分化率可達(dá)95.92%）；基本培養(yǎng)基和不同激素對分化率產(chǎn)生影響，在4個因素中，基本培養(yǎng)基和6-BA是影響分化率的主要因素，IBA和GA3為次要因素；篩選出的不同培養(yǎng)基組合對增殖系數(shù)影響不同，最高為4.14，且芽苗生長狀況良好；繼代周期為30 d時，增殖效果最好。

藍(lán)靛果忍冬；分化；培養(yǎng)基；正交試驗(yàn)；增殖系數(shù)

藍(lán)靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.var.edulisTur?cz.ex Herd），又名藍(lán)靛果、黑瞎子果、山茄子等，是忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木，主要分布在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、日本及朝鮮北部和我國東北、內(nèi)蒙古及華北等地區(qū)[1-2]，是新興的野生和栽培漿果資源，其果實(shí)富含糖類、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素和多種微量元素，既可生食，也可用于加工和園林綠化及提取天然食用紅色素，具有較高藥用價值[3]。缺乏人工培育優(yōu)良品種和野生資源日益枯竭是目前制約藍(lán)靛果忍冬發(fā)展的主要問題。因此，把藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)與培育新品種結(jié)合進(jìn)行研究，對提高幼苗繁殖效率、加速育種進(jìn)程、保護(hù)和合理利用藍(lán)靛果忍冬品種資源、大幅度提高其經(jīng)濟(jì)和開發(fā)價值等具有重要理論和實(shí)踐意義。

國內(nèi)外學(xué)者對藍(lán)靛果忍冬組培快繁技術(shù)研究工作已取得一定進(jìn)展。Ding等對外植體消毒和最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選[4-5]。趙越等以莖段為外植體，成功誘導(dǎo)出愈傷組織及試管苗，幼苗成活率在90%以上[6-7]。楊振國等以腋芽為外植體進(jìn)行組培快繁，篩選出適宜培養(yǎng)基，增殖系數(shù)達(dá)3.3[8-9]。但已有研究都是以現(xiàn)有品種為材料進(jìn)行，由于組培快繁技術(shù)效果受多因素多水平制約，試驗(yàn)設(shè)計上很難綜合考慮，結(jié)果有局限性。本文以中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所選育的藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品系L1-8為材料，利用正交試驗(yàn)對其組培分化培養(yǎng)基進(jìn)行多因素多水平優(yōu)化篩選，把組培快繁技術(shù)研究與培育新品種相結(jié)合，有較強(qiáng)針對性和目的性，可為藍(lán)靛果忍冬產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所選育的藍(lán)靛果忍冬優(yōu)良品系L1-8。試驗(yàn)于2012～2013年在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所區(qū)域農(nóng)業(yè)中心進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

在容器中先加入約一半體積的蒸餾水，按各培養(yǎng)基配方依次加入預(yù)先配好的母液（大量元素、微量元素、肌醇、Fe鹽、VB1、VB6、煙酸、甘氨酸等）。每1 000 mL溶液中加入蔗糖30 g、瓊脂7 g，調(diào)節(jié)pH至5.8。將配制好的培養(yǎng)基溶液分裝到三角瓶中，用封口膜封瓶口，121℃滅菌20 min。

1.2.2 外植體的獲得和消毒

采集藍(lán)靛果休眠枝條，流水沖洗3 h，水培至腋芽萌發(fā)。取長約0.5 cm的外植體腋芽，無菌水沖洗后，用75%乙醇處理10 s，再用0.1%氯化汞溶液處理10 min。每次外植體消毒后均用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干表面水分后待用。

1.2.3 無菌芽苗的培養(yǎng)

在超凈工作臺上將消毒過的腋芽接入1/2MS+ 6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基中，在芽苗高接近三角瓶頂部時，取出切段進(jìn)行分化培養(yǎng)。

1.2.4 分化培養(yǎng)

以4種基本培養(yǎng)基（MS、White、WPM、A3）、3種激素（IBA、6-BA、GA3）的4個濃度為因素和水平，用L16（45）正交表設(shè)計4因素、4水平正交試驗(yàn)。將獲得的無菌芽苗截成長約1.5 cm的莖段，分別接種于各分化培養(yǎng)基中，每個處理10瓶，每瓶5個莖段。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計分化率。進(jìn)行極差分析和方差分析，以篩選出最佳分化培養(yǎng)基配方。

1.2.5 不定芽的增殖培養(yǎng)

取經(jīng)分化培養(yǎng)生長情況一致的芽苗，接種在由正交試驗(yàn)結(jié)果分析篩選出的對分化率影響較大的培養(yǎng)基組合中。每個處理10瓶，每瓶5個芽苗，培養(yǎng)30 d后計算增殖系數(shù)，分析不同培養(yǎng)基和激素組合對L1-8不定芽增殖的影響。

取生長一致的芽苗，接種在增殖系數(shù)較高的培養(yǎng)基中，分別繼代15、20、25、30、35、40 d，計算各時期增殖系數(shù)，分析不同繼代周期對L1-8不定芽增殖的影響。

1.2.6 培養(yǎng)條件

室內(nèi)培養(yǎng)溫度（24±2）℃，光照時間12 h·d-1，光照強(qiáng)度約為50 μmol·m-2·s-1。

1.2.7 計算公式與數(shù)據(jù)處理

分化率（%）=已分化的芽苗莖段數(shù)/接種的總芽苗莖段數(shù)×100%增殖系數(shù)=產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的總芽數(shù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基和激素處理組合對L1-8不定芽分化率的影響

2.1.1 正交試驗(yàn)分化率的極差分析

表1列出正交試驗(yàn)結(jié)果中各處理組合分化率和極差分析值。

由表1可知，不同種類基本培養(yǎng)基和3種激素（6-BA、IBA和GA3）不同濃度間處理組合均可誘導(dǎo)外植體分化；各處理分化率為31.67%～95.92%，其中3號處理組合分化率最高，為95.92%，比分化率最低的13號處理組合（31.67%）高64.25%。各因素的極差（R）大小依次為基本培養(yǎng)基（25.97）、6-BA（24.68）、IBA（14.07）和GA3（13.39），說明各因素對分化率影響的主次順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基＞6-BA＞IBA＞GA3，即影響外植體分化效果的主要因素是基本培養(yǎng)基，其次是6-BA和IBA，GA3影響效果最??；各因素的優(yōu)水平為：MS基本培養(yǎng)基、2.0 mg·L-1的6-BA、0.3 mg·L-1的IBA及2.0 mg·L-1的GA3；各優(yōu)水平搭配即為最優(yōu)組合（MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA32.0 mg·L-1）。

表1 不同基本培養(yǎng)基和激素處理組合對L1-8分化率的影響Table 1 Effect of different medium and hormone combination on L1-8 tissue culture seedlings differentiation rate

由極差分析法得出的最優(yōu)組合與正交試驗(yàn)中分化率最高的3號處理組合基本相同，二者區(qū)別只在于GA3濃度不同，前者為2.0 mg·L-1，后者為1.5 mg·L-1?？紤]到GA3對分化率的影響最小，且3號處理可節(jié)省1/4的GA3使用量，降低成本，因此無需后續(xù)補(bǔ)充試驗(yàn)，即可把3號處理組合確定為最優(yōu)組合。

2.1.2 正交試驗(yàn)分化率的方差分析

對4個因素進(jìn)行方差分析結(jié)果表明，各因素對外植體分化率的影響均達(dá)到顯著水平，其中基本培養(yǎng)基和6-BA達(dá)極顯著水平（見表2），說明基本培養(yǎng)基和不同激素都對分化率產(chǎn)生影響，在優(yōu)化分化培養(yǎng)基時既要重視基本培養(yǎng)基的篩選，也要重視激素種類和濃度的篩選。在這四個因素中，基本培養(yǎng)基和6-BA是影響分化率的主要因素，IBA和GA3是次要因素。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance of the different culture medium and hormone

對各因素不同水平的平均分化率進(jìn)行多重比較結(jié)果表明（見表3），不同基本培養(yǎng)基對分化率的影響效果為MS＞W(wǎng)PM＞W(wǎng)hite＞A3，各基本培養(yǎng)基對分化率的影響存在顯著差異，其中MS的平均分化率（72.73%）極顯著高于其他3個基本培養(yǎng)基，A3的平均分化率（46.76%）極顯著低于其他3個基本培養(yǎng)基（見表3）；不同濃度6-BA對分化率的影響效果為2.0 mg·L-1＞1.5 mg·L-1＞2.5 mg·L-1＞1.0 mg·L-1，各濃度對分化率的影響存在極顯著差異，濃度為2.0 mg·L-1的平均分化率（71.67%）極顯著高于其他3個濃度（見表4）；不同濃度IBA對分化率的影響效果為0.3 mg·L-1＞0.4 mg·L-1＞0.1 mg·L-1＞0.2 mg· L-1，濃度為0.3 mg·L-1的平均分化率（68.55%）極顯著高于其他3個濃度，濃度為0.2 mg·L-1的平均分化率（54.48%）極顯著低于其他3個濃度（見表5）；不同濃度GA3對分化率的影響效果為2.0 mg·L-1＞0.5 mg·L-1＞1.0 mg·L-1＞0.5 mg·L-1，GA3濃度為2.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1的平均分化率（68.96%和64.87%）極顯著高于其他2個濃度（56.87%和55.57%），2.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1和0.5 mg·L-1濃度差異不顯著（見表6）。

表3 基本培養(yǎng)基平均分化率的多重比較Table 3 Cultivation of multiple comparison analysis table

表4 不同濃度6-BA平均分化率的多重比較Table 4 6-BA multiple comparison table

表5 不同濃度IBA平均分化率的多重比較Table 5 IBA multiple comparison table

表6 不同濃度GA3平均分化率的多重比較Table 6 GA3multiple comparison table

方差分析和多重比較結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基類型和不同激素種類及其濃度均會對分化率產(chǎn)生影響；適宜于藍(lán)靛果忍冬L1-8品系腋芽外植體分化最佳基本培養(yǎng)基為MS，6-BA濃度為2.0 mg·L-1，IBA濃度為0.3 mg·L-1，GA3濃度為2.0 mg·L-1或1.5 mg·L-1，最佳基本培養(yǎng)基與激素組合為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA32.0 mg·L-1或MS+ 6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA31.5 mg·L-1，與極差分析法結(jié)果一致。

2.2 不同基本培養(yǎng)基和激素組合對L1-8不定芽增殖系數(shù)的影響

由表7可知，不同種類及濃度的培養(yǎng)基和激素組合對L1-8不定芽增殖系數(shù)影響較大，16個處理組合中，以3號組合增殖系數(shù)最高，達(dá)4.14，極顯著高于其他各組合，且分化的芽苗粗壯，生長狀況最好；2號和4號組合增殖系數(shù)分別為2.54和3.15，分別較3號組合低1.60和0.99，芽苗生長狀況較3號組合稍差，二者間差異極顯著；1、5、7、8和15號組合增殖系數(shù)均達(dá)到1.0以上，分別為1.84、1.01、1.15、1.14和1.12，芽苗生長狀況一般；6、9、10、11、12、13、14和16號組合增殖系數(shù)均在1.0以下，分別為0.84、0.14、0.22、0.26、0.46、0.72、0.86和0.76，芽苗生長狀況較差。

表7 不同基本培養(yǎng)基和激素組合對L1-8不定芽增殖系數(shù)的影響Table 7 Effect of different culture and hormone combination on L1-8 bud multiplication

2.3 不同繼代周期對L1-8不定芽增殖的影響

由表8可知，不同繼代周期對L1-8不定芽的增殖有不同影響，其整體變化趨勢先增大后減小，繼代周期為15 d時，增殖系數(shù)為3.04；繼代周期為20和25 d時，增值系數(shù)分別達(dá)3.44和3.60，較15 d時分別增加0.40和0.56，差異不顯著，芽苗生長狀況相對較好；繼代周期為30 d時，增殖系數(shù)最高，為4.20，顯著或極顯著高于其他各處理；繼代周期為35和40 d時，增殖系數(shù)分別低至3.86 和3.22，差異極顯著，說明繼代增殖系數(shù)在這一階段下降較大。繼代周期過短（15 d）和過長（40 d），芽苗相對細(xì)弱，生長狀況差。因此L1-8最適宜的繼代周期為30 d。

表8 不同繼代周期對L1-8不定芽增殖系數(shù)的影響Table 8 Effect of different subculture cycle on L1-8 not multiplication

3 討 論

本試驗(yàn)在藍(lán)靛果忍冬L1-8品系腋芽外植體的分化培養(yǎng)中采用4種基本培養(yǎng)基，即MS、White、WPM和A3（一種草莓專用培養(yǎng)基），每種基本培養(yǎng)基所含有機(jī)物和無機(jī)鹽成分均不同。結(jié)果表明，MS基本培養(yǎng)基最適宜L1-8品系腋芽外植體的分化培養(yǎng)，與MS基本培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和離子濃度較高、養(yǎng)分?jǐn)?shù)量和比例合適有關(guān)，在今后藍(lán)靛果忍冬組織培養(yǎng)研究工作中，可按照適當(dāng)增加某種離子濃度優(yōu)化篩選培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)效果和增殖系數(shù)。

內(nèi)源激素和外源激素也對組織培養(yǎng)過程起重要調(diào)控作用，生長素和細(xì)胞分裂素合理搭配對外植體的分化影響最大。梁鉆姬等研究表明，生長素和細(xì)胞分裂素配合使用比單一激素更能促進(jìn)幼芽的分化和增殖。藥用植物華澤蘭增殖培養(yǎng)中，將6-BA和IBA配合使用，增殖系數(shù)高，幼芽萌發(fā)速度快，形成大量叢生芽，長勢良好[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)靛果忍冬腋芽外植體分化培養(yǎng)的最佳組合為MS＋2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1GA3，繼代周期為30 d，分化率和不定芽增殖系數(shù)最高，芽苗生長狀況良好。其他激素配比組合分化率較低原因是由于不同種類激素間生理效應(yīng)相互拮抗所致。過短或過長的繼代周期對不定芽的增殖均不利，前者是苗的復(fù)壯周期不足所致，后者是生長高峰期已過或培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不足所致。

4 結(jié)論

a.分化培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+GA31.5 mg·L-1，分化率可達(dá)95.92%。

b.基本培養(yǎng)基和不同激素都會對分化率產(chǎn)生影響，在4個因素中，基本培養(yǎng)基和6-BA是影響分化率的主要因素，IBA和GA3是次要因素。

c.不定芽增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基組合與分化培養(yǎng)篩選的最佳培養(yǎng)基相同，增殖系數(shù)可達(dá)4.14。

d.繼代周期為30 d時，增殖效果最好。

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Screening and optimization ofLonicera edulisdifferentiation culture

LI Fuheng1,QU Di1,ZHAO Hengtian2,ZHU Huijie1,YANG Hongsheng1,XU Qinghua1,LI Nanding1(1. School of Life Sicences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Northeast Institute of Geography andAgricultural Ecology,ChineseAcademy of Sciences,Harbin 150081,China)

Lonicera edulisstrain,designated strain L1-8 that provided by Chinese Academy of Science,Northeast Institute of Geography and Agricultural Ecology Institute,was applied as material in this research.The dormant branches of axillary buds were used as explants for germination.The medium(MS, White,WPM,A3),hormone IBA(0.1,0.2,0.3,0.4 mg·L-1),6-BA(1.0,1.5,2.0,2.5 mg·L-1)and GA3(0.5,1.0, 1.5,2.0 mg·L-1)were applied for the four factors-four levels orthogonal experiment which in order to optimize the best differentiation medium and provide technical support for the perfection of tissue culture technology ofLonicera edulismicropropagation.The results showed that MS medium containing 2.0 mg·L-16-BA,0.3 mg·L-1IBA and 1.5 mg·L-1GA3（The differentiation rate was 95.92%）was screened as the optimum differentiation medium.The basic medium and the different hormone both could affect the differentiation rate. In the four factors,the basic medium and 6-BA were the main factors affected the differentiation rate, whereas IBA and GA3were the secondary factors.Screened on different culture combinations had different effects on multiplication.The multiplication was as high as 4.14 with the best growth.Subculture cycle was 30 d and the effect on multiplication was the best.

Lonicera edulis;differentiation;culture;orthogonal test;multiplication

S663.9

A

1005-9369（2014）07-0073-06

時間2014-7-7 8:14:37 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140707.0843.019.html

李富恒,曲迪,趙恒田,等.藍(lán)靛果忍冬分化培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(7):73-78.

Li Fuheng,Qu Di,Zhao Hengtian,et al.Screening and optimization ofLonicera edulisdifferentiation culture[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(7):73-78.(in Chinese with English abstract)

2013-12-13

國家外國專家局2013年度引進(jìn)國外技術(shù)、管理人才項(xiàng)目（20132300046）

李富恒（1962-），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锷砩?。E-mail：lifuheng1963@126.com