利用豬流行性腹瀉病毒S基因真核表達(dá)質(zhì)粒制備多克隆抗體

任曉峰，王雪，高睿澤，董博，李廣興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

REN Xiaofeng,WANG Xue,GAO Ruize,DONG Bo,LI Guangxing(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

利用豬流行性腹瀉病毒S基因真核表達(dá)質(zhì)粒制備多克隆抗體

任曉峰，王雪，高睿澤，董博，李廣興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

將流行性腹瀉病毒（PEDV）S基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-S作為抗原，免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體?？贵w經(jīng)純化后,利用間接ELISA、間接免疫熒光、Western Blot方法檢測(cè)制備多克隆抗體的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，用PEDV S基因真核表達(dá)質(zhì)粒免疫制備的多抗血清抗體效價(jià)可達(dá)1∶214，該多克隆抗體不僅可以很好地識(shí)別PEDV S蛋白，還可以特異性檢測(cè)到PEDV抗原。研究為PEDV的診斷和S蛋白免疫學(xué)特性研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

豬流行性腹瀉病毒；S蛋白；真核表達(dá)質(zhì)粒；多克隆抗體

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的病毒性高度傳染性腸道類(lèi)疾病[1]。PEDV在組成結(jié)構(gòu)、臨床癥狀及對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生損害等方面與TGEV情況相似[1-2]。該病于1971年被英國(guó)首次報(bào)道并隨后蔓延歐洲、亞洲國(guó)家[3-7]。比利時(shí)Pensaert 1977年分離鑒定毒株（CVL）CV777株[8]，我國(guó)1980年初次分離PEDV。此病對(duì)生長(zhǎng)育肥豬感染率為20%～80%，死亡率低，但新生仔豬病死率，高達(dá)34%[9]。臨床癥狀表現(xiàn)為脫水、腹瀉和嚴(yán)重嘔吐，并伴有精神萎靡、食欲不振、體重減輕等，癥狀輕重與年齡大小呈反比[10]。按照多種冠狀病毒S蛋白相似性，S蛋白全長(zhǎng)分為（1～735 aa）的S1區(qū)和（736～1 383 aa）的S2區(qū)[11]。Sun等利用截短后的S基因SID區(qū)（696～789 aa）連接原核載體后表達(dá)蛋白免疫動(dòng)物后獲得多抗血清，顯示此血清可以中和PEDV[12]。本研究利用PEDV的pVAX1-S全長(zhǎng)質(zhì)粒經(jīng)大提質(zhì)粒并純化后，免疫BALB/c小鼠，制備抗S的多抗高效血清，不僅可以應(yīng)用于PEDV的免疫學(xué)特性研究，而且為進(jìn)一步建立起特異性診斷方法提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株毒株載體及細(xì)胞

克隆菌株JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存；PEDV分離株（CV777），登錄號(hào)為（AF353511.1）真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-PEDV S，PEDV S1蛋白為本實(shí)驗(yàn)室制備；BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；酶制劑Bam HⅠ和Eco R I、EXT DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自北京中杉公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO公司；DNA Maker購(gòu)自大連寶生物公司；低蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自大連寶生物公司；兔抗豬PEDV全病毒多克隆抗體本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡BALB/c小鼠，購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒pVAX1-S轉(zhuǎn)化進(jìn)JM109克隆感受態(tài)中。將單菌落接種在添加Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)LB液體培養(yǎng)基變渾濁。將菌液提取質(zhì)粒作PCR鑒定，雙酶切鑒定。引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primer

PCR體系為25 μL體系，體系中加入10×PCR Buffer 2.55 μL，引物P1 0.5 μL，引物P2 0.5 μL，模板3.0 μL，Ex Taq 0.3 μL，ddH2O 18.2 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，53.5℃退1 min，72℃延伸3 min，本反應(yīng)共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸6 min?？捎?℃保存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將pVAX1-S質(zhì)粒使用Bam H I和EcoR I，兩種限制性酶雙酶切，酶切體系如下：37℃反應(yīng)1.5 h。10 μL體系中加入10×K Buffer1.0 μL，pVAX1-S質(zhì)粒1.0 μL，Eco R I和Bam H I各0.5 μL，ddH2O 7.0 uL。

1.2.2 真核質(zhì)粒的體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將BHK-21細(xì)胞傳于鋪好滅菌爬片的24孔細(xì)胞板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞面積70%～80%時(shí)即可轉(zhuǎn)染。取純化2 μg pVAX1-S質(zhì)粒放入到裝有50 μL DMEM的EP管中，混勻；2 μg脂質(zhì)體溶液加入到裝有50 μL DMEM的EP管中，混勻，作用5 min；將以上兩EP管的溶液混合靜止15 min；將混合液加入相應(yīng)各孔，溫箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)置pVAX1空載體和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞對(duì)照。

1.2.3 間接免疫熒光方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的表達(dá)

細(xì)胞固定30 min后；PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，加入一抗1∶200的兔抗豬PEDV全病毒多克隆抗體作用60 min；PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，二抗為FITC羊抗兔IgG二抗，暗室作用50 min；PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，封片劑固定封片后使用熒光顯微鏡觀察熒光結(jié)果。

1.2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒的大量制備

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli JM109中。挑取單個(gè)菌落接種于含AMP+的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至LB變渾濁；加5 mL經(jīng)活化后的菌液在500 mL LB培養(yǎng)液中，37℃搖床中震蕩培養(yǎng)12 h；6 000 r·min-1，4℃離心20 min；收集菌體沉淀，用200 mL冷STE溶液懸起沉淀，加入SolutionⅠ18 mL和新配置的10 mg·mL-1溶菌酶2 mL，混勻后加入配置的SolutionⅡ40 mL輕輕上下顛倒混勻，靜置10min；加冷的SolutionⅢ20 mL，小心來(lái)回混勻，冰上冷卻10 min；6 000 r·min-1，4℃離心30 min；取上清使其通過(guò)4層紗布去除雜質(zhì)，加入適量異丙醇后搖晃均勻，靜置10 min；常溫下10 000 r·min-1離心15 min，棄去上層清液，回收沉淀；用含70%的乙醇清洗管底及管壁；沉淀用3 mL TE懸起即為大量制備pVAX1-S的DNA。聚乙二醇沉淀法純化。

1.2.5 試驗(yàn)動(dòng)物分組及其免疫

將4只6周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分成2組（試驗(yàn)組和空白對(duì)照），每組2只。小鼠大腿肌肉注射50 μL鹽酸利多卡因，5 min后將稀釋好的濃度為1 μg-1的pVAX1-S注射試驗(yàn)組小鼠。間隔2周免疫1次，3免1周加強(qiáng)免疫1次，1周后眼球取血處死。

1.2.6 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

用間接ELISA檢測(cè)多克隆抗體血清抗體效價(jià)，用PEDV病毒包被ELISA板，100 μL·孔-1，4℃包被過(guò)夜；PBST洗孔3次，每次5 min，用含5%脫脂乳PBST溶液37℃封閉3 h；一抗為倍比系列稀釋的免疫鼠陽(yáng)性和隱性血清，二抗為1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃作用1 h；PBST洗孔3次，每次5 min，加入OPD-H2O2底物顯色液，OPD避光顯色，OD490讀數(shù)。P/N＞2即可判為陽(yáng)性。

1.2.7 Western Blot檢測(cè)

將本實(shí)驗(yàn)室保存的重組PEDV S1蛋白從SDSPAGE電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜，用含5%脫脂乳的PBST，4℃封閉過(guò)夜，2道用制備的陽(yáng)性血清為一抗1∶200稀釋37℃作用1 h，1道為陰性血清對(duì)照；PBST洗膜3次，每次10 min，以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗1∶3 000稀釋?zhuān)?7℃作用1 h；PBST洗膜3次，每次10 min，顯色液顯色，并拍照。

1.2.8 間接免疫熒光試驗(yàn)

將PEDV病毒感染BHK-21細(xì)胞，感染后24 h，進(jìn)行間接免疫熒光。將細(xì)胞固定30 min，PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，一抗為1∶200的兔抗PEDV全病毒多抗，作用60 min；PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，分別加入FITC羊抗兔IgG二抗，暗室作用50 min；PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min，封片劑固定封片，使用熒光顯微鏡觀察熒光結(jié)果。

1.2.9 病毒交叉反應(yīng)

將PrV，PRV，PRRSV，PPV，PCV2，TGEV, PEDV的病毒液進(jìn)行濃度測(cè)定。病毒和病毒裂解液按4∶1的比例加入裂解病毒30 min。每孔包被病毒量為10 μg，同時(shí)設(shè)置包被DMEM，PBST，病毒裂解液的陰性對(duì)照孔。4℃包被過(guò)夜，5%脫脂乳37℃封閉3 h，PBST洗孔3次，每次5 min；一抗用制備的免疫鼠多抗血清1∶500稀釋?zhuān)?7℃作用1 h，PBST洗孔3次，每次5 min；二抗用山羊抗鼠IgG 1∶5 000稀釋?zhuān)?7℃作用50 min，PBST洗孔3次，每次5 min；加入OPD-H2O2底物顯色液，OPD避光顯色，OD490讀數(shù)。P/N＞2即可判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

真核質(zhì)粒pVAX1-S（見(jiàn)圖1）。經(jīng)PCR鑒定為4 152 bp大小正確，經(jīng)Bam H I和Eco R I雙酶鑒定載體帶為3 000 bp，目的帶為4 152 bp，大小正確（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，本試驗(yàn)已成功構(gòu)建pVAX1-S，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 PCR鑒定Fig.1 Identification of PCR

圖2 雙酶切鑒定Fig.2 Identification of double enzyme digestion

2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

將真核表重組質(zhì)粒pVAX1-S瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞24 h后通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室自制PEDV全病毒多抗，使用間接免疫熒光法顯微鏡觀察重組質(zhì)粒pVAX1-S表達(dá)效果。

由圖3可見(jiàn)，在熒光顯微鏡下可以看到C中轉(zhuǎn)染pVAX1-S細(xì)胞大量表達(dá)綠色熒光，而在A中未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和B中空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組都未表達(dá)綠色熒光。結(jié)果說(shuō)明真核質(zhì)粒pVAX1-S可在BHK-21細(xì)胞中成功瞬時(shí)表達(dá)S蛋白，可將此質(zhì)粒用于真核免疫。

圖3 免疫熒光檢測(cè)重組質(zhì)粒pVAX1-S在BHK21細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Fig.3 Detection of the expression of recombinant eukaryotic plasmid pVAX1-S in BHK-21 cell by IIF

2.3 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

PEDV病毒包被ELISA板，用間接ELISA方法檢測(cè)經(jīng)倍比稀釋的多抗血清抗體效價(jià)，陰性鼠血清同樣經(jīng)倍比稀釋作為隱性對(duì)照，酶標(biāo)儀讀取490 nm處每孔吸光光度值，P/N＞2可作為判定依據(jù)。判定結(jié)果顯示所制備多克隆抗體血清效價(jià)為214。

2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)

將病毒感染的細(xì)胞經(jīng)間接免疫熒光法后鏡下觀察。結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3A為細(xì)胞對(duì)照，沒(méi)有任何熒光信號(hào)出現(xiàn)；圖3B為檢測(cè)血清組，可以發(fā)現(xiàn)很多熒光信號(hào)出現(xiàn)；圖3C為使用陰性血清組，未發(fā)現(xiàn)任何熒光信號(hào)。表明制備的鼠多抗作為一抗可觀察到特異性綠熒光信號(hào)，進(jìn)一步說(shuō)明本試驗(yàn)制備的鼠多抗可特異性與PEDV結(jié)合。

2.5 Western Blot檢測(cè)

用制備的陽(yáng)性血清和鼠陰性血清為一抗，檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)室已制備的PEDV-S1蛋白（61.0 ku），Western Blot結(jié)果如圖4，第2道所加一抗為陽(yáng)性血清，其與S1蛋白能夠結(jié)合并出現(xiàn)特異性條帶；第1道為陰性血清，與S1蛋白未出現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，比較說(shuō)明制備的S多抗可以特異性地識(shí)別截短表達(dá)的S蛋白。

圖3 免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體特異性Fig.3 Detection of antibody specificity by IF

圖5 Western Blot檢測(cè)抗多克隆抗體特異性Fig.5 Detection of antibody specificity by Western Blot

2.6 病毒交叉反應(yīng)

通過(guò)病毒交叉反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)PEDV和實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)幾種豬病毒PPV、PrV、TGEV、PRRSV、PCV2、PEDV和PRV進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖6，用制備的多抗血清檢測(cè)包被PEDV的試驗(yàn)孔和包被其他種病毒的試驗(yàn)孔相比，結(jié)果顯示，數(shù)值差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明用此制備的鼠血清多克隆抗體，比檢測(cè)物的間接ELISA檢測(cè)方法有良好特異性，與其他常見(jiàn)豬病毒之間不存在交叉反應(yīng)，可作為檢測(cè)試劑。

3 討論與結(jié)論

一般用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白進(jìn)行多抗制備，但由于原核表達(dá)系統(tǒng)自身問(wèn)題，表達(dá)的目的蛋白與天然蛋白之間在空間構(gòu)象及蛋白糖基化方面存在問(wèn)題。PEDV表面纖突糖蛋白（S蛋白）有較大分子質(zhì)量（180～220 ku），原核表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法將其糖基化，也不易表達(dá)較大分子質(zhì)量蛋白。盡管研究指出以SID區(qū)（696～789 aa）截短重組S蛋白制備出多抗血清可以中和豬流行性腹瀉病毒[13]。但高娃發(fā)現(xiàn)S蛋白全長(zhǎng)比單獨(dú)SID區(qū)免疫效果更好[14]。

本試驗(yàn)將PEDV的S（4 152 bp）全長(zhǎng)基因與真核表達(dá)載體pVAX1連接構(gòu)建pVAX1-S質(zhì)粒，經(jīng)純化后將DNA注射到小鼠體內(nèi)，在鼠體內(nèi)表達(dá)外源基因，利用鼠體表達(dá)蛋白作為機(jī)體免疫系統(tǒng)激活抗原，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答，達(dá)到產(chǎn)生抗體目的。該方法優(yōu)點(diǎn)在于利用機(jī)體本身表達(dá)活性蛋白，產(chǎn)生抗體后效果較好，且抗體可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生。

試驗(yàn)中選用的真核表達(dá)載體pVAX1由INVIT?ROGEN公司將pcDNA3.l載體演變改造優(yōu)化，具備核酸疫苗制備中載體條件，pVAX1載體一方面可使多個(gè)較大目的基因片段同時(shí)克隆，另一方面強(qiáng)啟動(dòng)子pCMV和BGH polyA尾信號(hào)也可促進(jìn)重組蛋白高水表達(dá)于免疫動(dòng)物細(xì)胞中。所含CMV啟動(dòng)子還會(huì)影響翻譯后的修飾從而進(jìn)一步提高免疫效果。本試驗(yàn)應(yīng)用pVAX1作為核酸疫苗真核表達(dá)載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-S，用于免疫小鼠模型，制備多抗。

本試驗(yàn)以脂質(zhì)體作為傳染劑將真核pVAX1-S質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BHK-21細(xì)胞中，利用間接免疫熒光法顯微鏡檢測(cè)是否可以在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示，只有pVAX1-S轉(zhuǎn)染組多數(shù)細(xì)胞中有綠色熒光出現(xiàn)，而空載體組和正常細(xì)胞組作為對(duì)照的組別，無(wú)任何熒光信號(hào)。綜合檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，本試驗(yàn)構(gòu)建的pVAX1-S重組質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且表達(dá)出S蛋白具有一定抗原活性，為進(jìn)一步制備多抗提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)利用大量提取重組質(zhì)粒經(jīng)純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，用間接ELISA測(cè)定檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果表明，產(chǎn)生的抗體水平較高；間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明其能夠特異性識(shí)別PEDV感染BHK-21細(xì)胞；Western Blot結(jié)果表明，制備多抗可和天然PEDV的S蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明制備抗體生物活性較高、特異性好。ELISA結(jié)果顯示，制備多抗可特異性檢測(cè)出PEDV抗原，可為PEDV診斷和研究S蛋白的免疫學(xué)特性提供試驗(yàn)依據(jù)。

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Preparation of polyclonal antibody withSgene eukaryotic expression plasmid of porcine epidemic diarrhea virus/

This experiment was undertaken to prepare polyclonal antibody by immunization of BALB/c mouse with PEDVSgene eukaryotic expression plasmid(pVAX1-S)as antigen.The biological activity of the polyclonal antibody was assayed by indirect ELISA,indirect immunofluorescence(IF)test and Western Blot. The results showed that the antiserum titer was 1∶214.Not only the recombinant S protein could be identified by the polyclonal antibody,but also the PEDV-derived S protein.This study provided experimental basis of characterization of PEDV immunological properties and disease diagnosis.

porcine epidemic diarrhea virus;Sgene;eukaryotic expression plasmid;polyclonal antibody

S828；S851

A

1005-9369（2014）06-0061-06

時(shí)間 2014-6-11 16:13:46 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1613.012.html

REN Xiaofeng,WANG Xue,GAO Ruize,DONG Bo,LI Guangxing(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)

任曉峰,王雪,高睿澤,等.利用豬流行性腹瀉病毒S基因真核表達(dá)載體制備多克隆抗體[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6):61-66.

Ren Xiaofeng,Wang Xue,Gao Ruize,et al.Preparation of polyclonal antibody with S gene eukaryotic expression plasmid of porcine epidemic diarrhea virus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):61-66.(in Chinese with English abstract)

2013-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31372438）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（20122325110019）；黑龍江省普通高等學(xué)校長(zhǎng)江學(xué)者后備支持計(jì)劃項(xiàng)目（2013CJHB002）

任曉峰（1974-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，黑龍江省“龍江學(xué)者”特聘教授。研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)與分子病毒學(xué)。E-mail:rxfemail@yahoo.com.cn