一株高活性黑木耳釀酒酵母的鑒定及其相關(guān)生物學(xué)特性分析

臧海蓮，邢振楠，范冬茹，王丹麗，熊明華

（1.伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春 153000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；3.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000）

一株高活性黑木耳釀酒酵母的鑒定及其相關(guān)生物學(xué)特性分析

臧海蓮1,2，邢振楠1，范冬茹1，王丹麗1，熊明華3

（1.伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春 153000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；3.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000）

為研究黑木耳發(fā)酵釀酒試驗(yàn)引進(jìn)多株酵母菌，對(duì)一株利用黑木耳釀酒活性較高的酵母進(jìn)行生理生化特性研究，為黑木耳發(fā)酵釀酒產(chǎn)業(yè)儲(chǔ)備菌種資源。將待測酵母標(biāo)記為J800，結(jié)合形態(tài)特征和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，將該菌株鑒定為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae sp.），此菌適宜在弱酸性環(huán)境中生長繁殖，最適生長條件：pH 4.6、32℃、陽離子濃度0.7%～1.0%；當(dāng)酒精含量達(dá)到15%以上，酵母生長受到較強(qiáng)抑制；發(fā)酵力0.62～0.70，培養(yǎng)基中蔗糖含量為20%時(shí)達(dá)到最大。

釀酒酵母；生物學(xué)特性；序列分析

黑木耳營養(yǎng)豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、糖類、各種微量元素和維生素，含有如卵磷脂、甘露聚糖、木糖等功能成分[1]。目前，依托成熟栽培技術(shù)及高產(chǎn)品種支撐，黑木耳栽培廣、產(chǎn)量大。據(jù)報(bào)道，2011年產(chǎn)干耳達(dá)3×105t[2]，我國木耳產(chǎn)量與消費(fèi)量均已躍居世界第一位[3]。黑木耳的營養(yǎng)性、功能性是研發(fā)黑木耳營養(yǎng)酒的前提[4]。在釀酒過程中準(zhǔn)確掌握發(fā)酵酵母生物學(xué)特性，對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酒品有重要意義。本文對(duì)一株引進(jìn)酵母耐酒精、發(fā)酵、耐酸等能力進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其是否可利用黑木耳發(fā)酵代謝產(chǎn)酒，并對(duì)該株酵母進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，以確定其屬種，并驗(yàn)證該酵母在一定環(huán)境因素作用下利用黑木耳釀酒可行性及品質(zhì)，獲得更多該菌株特征屬性，為黑木耳釀酒與工藝流程設(shè)計(jì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

菌種來源：伊春林業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳育種室保存，暫命名為J800。

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加重蒸餾水至1 L，pH自然。

Gorodkowa培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加重蒸餾水至1 L，pH自然。

培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)按2%比例添加瓊脂粉。

1.2 酵母菌株鑒定

將酵母菌株J800分別接種于液體和固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)1～3 d后觀察培養(yǎng)液狀態(tài)及菌落形態(tài)，美藍(lán)染色顯微鏡觀察菌體形態(tài)及繁殖方式，參照文獻(xiàn)[5-6]對(duì)該株酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

[7]采用酵母菌的26S rDNA通用引物進(jìn)行菌株種屬鑒定。經(jīng)UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒提取J800基因組，采用26S rDNA D1/ D2區(qū)引物：NL1：5′GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG 3′；NL4：5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3′，引物由上海生工有限公司合成，參考文獻(xiàn)[8]反應(yīng)體系及條件進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收目的DNA片段，并進(jìn)行序列分析，測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較，采用DNAman 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 酵母菌株性能測定

測繪酵母J800的生長曲線，在該株菌的生長優(yōu)勢時(shí)段進(jìn)行不同性能檢測，分光光度計(jì)光度掃描，確定最佳檢測波長。取活化后酵母J800 2 mL，接種于100 mL液體YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1擴(kuò)繁20 h，檢測性能備用。

分別以26、28、30、32、34℃作為溫度試驗(yàn)組；以酒精添加量5%、10%、15%、17.5%、20%、25%的液體YPD培養(yǎng)基作為耐酒精試驗(yàn)組；以添加0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%檸檬酸，配置不同pH的培養(yǎng)液作為酵母J800耐酸性試驗(yàn)組；將氯化銨和氯化鈣按照2∶1混合均勻后分別在YPD培養(yǎng)液中添加0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%，配置含不同陽離子濃度的培養(yǎng)液，作為陽離子耐受能力檢測組；分別向培養(yǎng)基中添加0、2%、5%、10%、15%、20%、20%、25%、30%的蔗糖檢測酵母J800的發(fā)酵能力[發(fā)酵力=（發(fā)酵前醪中分析總糖-發(fā)酵后醪中殘余總糖）/發(fā)酵前醪中分析總糖][9-10]。以上各檢測組培養(yǎng)基滅菌后分別接種酵母J800 2 mL，于28℃（溫度試驗(yàn)組以不同溫度培養(yǎng)）180 r·min-1培養(yǎng)，以未接種酵母及待測添加物的培養(yǎng)液作為對(duì)照，并設(shè)置3平行，測定培養(yǎng)后吸光值，繪制表示酵母J800各性能的趨勢曲線。

1.4 利用酵母J800釀造黑木耳營養(yǎng)酒

綜合木耳粉吸水能力，研究酵母用量、木耳粉用量、糖酸比例對(duì)發(fā)酵影響，黑木耳粉熟化后，調(diào)配發(fā)酵初始的糖酸度和時(shí)間及酵母菌添加比例（見表1），結(jié)合酵母J800特性設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)條件，進(jìn)行主發(fā)酵。為促進(jìn)發(fā)酵，及時(shí)調(diào)控CO2含量，添加1%助發(fā)酵物質(zhì)（氯化銨和氯化鈣重量比2∶1），并調(diào)控抑制雜菌生長。

表1 黑木耳酒發(fā)酵因素正交表Table 1 Black fungus wine fermentation factor orthogonal table

當(dāng)發(fā)酵瓶中CO2產(chǎn)生趨緩，糖度保持穩(wěn)定、無明顯下降，pH 3～4時(shí)即可判斷主發(fā)酵結(jié)束。按照正交試驗(yàn)安排中止主發(fā)酵，15～18℃的環(huán)境中靜止發(fā)酵產(chǎn)物，統(tǒng)一進(jìn)入后熟階段。成熟后，去掉發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行陳釀，根據(jù)發(fā)酵出酒澄清度、口味等指標(biāo)確定酒的品質(zhì)，檢測酵母J800利用黑木耳發(fā)酵釀酒能力及效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母J800菌株的鑒定及基于26S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)酵母J800進(jìn)行形態(tài)特征及生殖方式觀察結(jié)果描述見圖1及表2。

圖1 酵母J800形態(tài)特征Fig.1 Morphologic characteristic of yeast J800

表2 酵母J800的形態(tài)特征Table 2 Morphology characteristics of yeast J800

通過分子生物學(xué)鑒定，測得酵母J800 580 bp 26S rDNA D1/D2區(qū)序列堿基，序列已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)：JX944684。將其與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的8個(gè)模式株進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)育樹中菌株J800的26S rDNA序列與Saccharomyces cerevisiae strain D3C在同一小分支上，相似度最大，為93.39%，從圖2可確定，酵母J800屬于Saccharomyces cerevisiae菌屬。

圖2 酵母J800的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain J800

2.2 酵母J800生長曲線測定

據(jù)測定，7200型分光光度計(jì)掃描酵母培養(yǎng)液吸光值時(shí)，在560 nm時(shí)出現(xiàn)最大吸收峰，所以設(shè)定檢測波長為560 nm，繪制其生長曲線。如圖3所示，酵母J800在此培養(yǎng)條件下，20～24 h從對(duì)數(shù)期進(jìn)入穩(wěn)定期，此階段適合對(duì)其各項(xiàng)性能進(jìn)行檢測。

圖3 酵母J800生長曲線Fig.3 Growth curve of yeast J800

2.3 酵母J800不同性能的測定

如圖4A所示，在溫度為28～34℃時(shí)，酵母J800均能較好生長，其中溫度為32℃時(shí)，菌株生長狀況最好。由圖4B可知，酒精含量越高，酵母菌生長繁殖能力就越弱，當(dāng)酒精含量達(dá)到15%以上，酵母生長受到極大抑制。由圖4C可知，在耐酸性方面，酵母J800適宜在弱酸性環(huán)境中生長繁殖，在pH 4.4～5.0時(shí)其生長力最強(qiáng)。從圖4D可知，酵母菌在含0.7%～1.0%的陽離子培養(yǎng)液中生長量達(dá)最大。圖4E表明，該酵母菌發(fā)酵力與發(fā)酵液中（蔗）糖濃度有關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)液中糖濃度在5%～25%時(shí)，酵母菌發(fā)酵力受糖濃度影響不大，發(fā)酵力在0.62～0.70，其中當(dāng)蔗糖含量為20%時(shí)達(dá)最大。當(dāng)蔗糖濃度小于5%或大于25%時(shí)酵母菌的發(fā)酵力會(huì)有較大幅度降低。

2.4 酵母J800利用黑木耳發(fā)酵釀酒性能檢測

當(dāng)酵母J800、木耳粉、糖、有機(jī)酸按照0.8∶2∶20∶1比例28～32℃混合培養(yǎng)4 d，18℃沉淀15 d去掉發(fā)酵基質(zhì)陳釀一段時(shí)間后可獲得黑木耳發(fā)酵酒，經(jīng)檢測及品酒人驗(yàn)證，此試驗(yàn)條件下酵母J800利用黑木耳發(fā)酵代謝產(chǎn)酒清亮透明、淡棕黃色、氣味清新、醇厚、有木耳的特殊芳香、口感豐富。

圖4 酵母J800特性鑒定Fig.4 Yeast J800 characterization

3 討論與結(jié)論

黑木耳精深加工可對(duì)黑木耳營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行充分提取、分析，黑木耳可食、可補(bǔ)、可藥功能使其成為釀造營養(yǎng)酒首選。釀酒過程中所選酵母很重要，選取時(shí)需滿足生殖快，可耐高濃度糖、酸、酒精，發(fā)酵平穩(wěn)，酒精產(chǎn)率高，揮發(fā)酸生成少，代謝產(chǎn)物質(zhì)優(yōu)等條件。酒精濃度會(huì)抑制酵母菌的發(fā)酵能力，影響代謝速度，按照發(fā)酵所用酵母對(duì)酒精的耐受程度設(shè)計(jì)工藝流程提高生產(chǎn)效率及產(chǎn)品質(zhì)量。釀酒時(shí)入池的酒醅需一定酸度，抑制其他雜菌生長，在發(fā)酵釀酒過程中需均衡酒醅pH，最大程度滿足酵母菌體生長代謝和抑制雜菌生產(chǎn)要求。由于酵母的發(fā)酵能力不同，生產(chǎn)中對(duì)發(fā)酵醪中糖分等物質(zhì)利用程度不同，為保證生產(chǎn)上能用到發(fā)酵力強(qiáng)、發(fā)酵快速酵母菌種，在生產(chǎn)前模擬發(fā)酵條件進(jìn)行中小型試驗(yàn)，檢測酵母發(fā)酵能力，篩選適宜菌種，此過程是獲取最佳發(fā)酵產(chǎn)物的關(guān)鍵[11-12]。

由于酵母J800利用黑木耳發(fā)酵代謝產(chǎn)酒，影響因素復(fù)雜，待檢測參數(shù)較多，需進(jìn)行詳盡試驗(yàn)及多次平行試驗(yàn)，后期試驗(yàn)將深入研究、確定除發(fā)酵用酵母J800自身性質(zhì)外的黑木耳發(fā)酵酒生產(chǎn)過程中的其他影響因素，以確定最佳工藝流程。

酵母菌J800經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Saccharomyces cerevisiae sp.，最適生長溫度范圍為28～34℃，pH 4.4～5.0，陽離子濃度0.7%～1.0%，糖濃度5%～25%，酒精含量達(dá)到15%以下時(shí)酵母J800菌有高活性，利用黑木耳發(fā)酵產(chǎn)酒品質(zhì)良好，可用于發(fā)酵生產(chǎn)黑木耳營養(yǎng)酒。

[參考文獻(xiàn)]

[1]唐平,俞衛(wèi)平,支明玉.黑木耳的開發(fā)研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）,2012(5):99-102.

[2]劉家勇.打造全國食用菌產(chǎn)業(yè)“火車頭”[N].黑龍江日?qǐng)?bào),2012-2-6(9).

[3]馬云橋,張介弛.黑龍江省黑木耳菌種生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].北方園藝,2010(14):218-219.

[4]楊大毅,劉文玉.黑木耳發(fā)酵酒的研制[J].釀酒,2005,32(6):80-81.

[5]Barnett J A.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)[M].胡瑞卿,譯.青島:青島海洋大學(xué)出版社,1991.

[6]牛天貴.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002.

[7]唐玲,劉平,黃瑛,等.酵母的分子生物學(xué)鑒定[J].生物技術(shù)通報(bào), 2008(5):82-87.

[8]Katharina Z,Cecile M S,Olivier C,et al.Dyanamics and diversity of non-Saccharomyces yeasts during the early stages in winemarking[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125: 197-203.

[9]陳洪章,李佐虎.酵母菌的高密度發(fā)酵[J].工業(yè)微生物,1998,28 (1):28-31.

[10]趙晉府.食品技術(shù)原理[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2007.

[11]楊天英,趙金海.果酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2010.

[12]王大為,張艷榮,李玉.發(fā)酵型香菇酒生產(chǎn)工藝的研究[J].食品科學(xué),2004,25(12):82-87.

Identification and analysis of relevant biological characteristics of a high activeSaccharomyces cerevisiaewith black fungus/

ZANG Hailian1,2,XING Zhennan1,FAN Dongru1,WANG Danli1,XIONG Minghua3(1.Yichun Academy of Forestry Sciences,Yichun Heilongjiang 153000,China;2.School of Resources and Environmental Sciences, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;3.School of Life Sciences,Huaibei Normal University,Huaibei Anhui 235000,China)

For researching alcohol fermentation using black agaric as ingredients,several yeasts were purchased.One yeast,named as J800,showing higher fermentation capability was subject to further study.Combining morphologic and physiobiochemical characteristics with 26S rDNA sequence analysis,strain J800 was identified asSaccharomyces cerevisiaesp..The optimal growth condition for strain J800 was pH 4.6,32℃,0.7%-1.0%cation concentration.In addition,when alcohol concentration reached 15%or more in fermentation broth,the growth of strain J800 was strongly inhibited.The strain J800 reached the maximum fermentation force(0.62-0.70)at the sucrose concentration 20%in the medium.

Saccharomyces cerevisiae;biological characteristics;sequence analysis

S646.6

A

1005-9369（2014）06-0045-04

時(shí)間 2014-6-11 16:08:26 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1608.006.html

臧海蓮,邢振楠,范冬茹,等.一株高活性黑木耳釀酒酵母的鑒定及其相關(guān)生物學(xué)特性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(6): 45-48.

Zang Hailian,Xing Zhennan,Fan Dongru,et al.Identification and analysis of relevant biological characteristics of a high activeSaccharomyces cerevisiaewith black fungus[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):45-48.(in Chinese with English abstract)

2013-08-08

黑龍江省財(cái)政廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（2011-03）

臧海蓮（1984-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail:10303188@163.com