柴胡疏肝散對癲癇合并抑郁大鼠的行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響

楊萍，李亮，孫美珍

論著

柴胡疏肝散對癲癇合并抑郁大鼠的行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響

楊萍1，李亮2，孫美珍3

目的：探討柴胡疏肝散（CHSGS）對慢性癲癇合并抑郁大鼠的行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響。方法：24只癲癇合并抑郁（鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)）大鼠隨機分為模型組、氟西汀組和CHSGS組，每組8只，另設(shè)置正常對照組（n=8）。造模第21天后正常對照組予生理鹽水10 mL/kg，氟西汀組每日灌服氟西?。?.75 mg/kg）；CHSGS組每日灌服2.7 g生藥/kg，連續(xù)1月。利用糖水消耗試驗、曠場試驗及免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠的行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生改變。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組、氟西汀組、CHSGS組的糖水消耗及行為學(xué)評分明顯下降，海馬齒狀回新生神經(jīng)元增加（<0.05）。氟西汀組、CHSGS組糖水消耗及行為學(xué)評分較模型組明顯提高，海馬齒狀回新生神經(jīng)元增加（<0.05）；氟西汀組、CHSGS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：CHSGS能提高癲癇合并抑郁大鼠海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，改善抑郁癥狀。

柴胡疏肝散；癲癇；抑郁；齒狀回；神經(jīng)發(fā)生

癲癇與抑郁共存目前被認(rèn)為是神經(jīng)精神病學(xué)現(xiàn)象[1]。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇后抑郁發(fā)作可能與海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生有關(guān)[2]。筆者前期研究證實5羥色胺1A（5-hydroxytryptamine1A，5-HT1A） 受 體 激 動 劑8-OH-DPAT能提高海馬區(qū)新生神經(jīng)元生長[3]，但因5-HT1A受體激動劑臨床應(yīng)用的局限性及西藥副作用等問題，使其在臨床應(yīng)用中受到限制。中醫(yī)藥具有毒副作用小等特點，使得中醫(yī)藥治療癲癇合并抑郁越來越得到關(guān)注。本研究通過觀察中藥復(fù)方柴胡疏肝散（Chaihu-Shugan-San，CHSGS）對匹羅卡品誘導(dǎo)慢性癲癇大鼠合并抑郁模型的行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響，探討CHSGS是否通過改善海馬神經(jīng)發(fā)生來發(fā)揮抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組 成年雌性健康清潔級SD大鼠112只，體質(zhì)量180～220 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供；標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。隨機選取8只為正常對照組，另104只制備癲癇模型；從成功的癲癇模型大鼠中通過糖水消耗試驗及曠場實驗行為學(xué)選取評分較低的大鼠，并與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義的大鼠24只，隨機分為模型組、氟西汀組、CHSGS組，每組8只。

1.1.2 藥物與試劑 匹羅卡品（購于美國ABCR公司）；氯化鋰、BrdU（購于美國Sigma公司）；小鼠抗BrdU單克隆抗體（BM0201）、山羊抗小鼠 IgG-TRITC（SA1021）（購于武漢博士德公司）；CHSGS（由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供）。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型制備 腹腔注射氯化鋰3 mEq/kg（1 mEq/kg=2 mmol/kg），18 h后再給予匹羅卡品30 mg/kg，在注射匹羅卡品前20 min注射阿托品l mg/kg以拮抗外周膽堿能作用。對照組注射30 mg/kg生理鹽水。根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[4]，造模后出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）40 min即給予地西泮4 mg/kg和10%水合氯醛3 mL/kg，終止發(fā)作；Racine分級≥Ⅳ級并存活者入組。

1.2.2 癲癇合并抑郁模型大鼠的篩選 于制模后第21天進行。①糖水消耗試驗：造模前訓(xùn)練大鼠適應(yīng)飲糖水，每籠同時放置2個水瓶，第一個24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h，一個瓶裝1%蔗糖水，另一個瓶裝純水。禁水24 h后，進行動物的基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗。同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水和一瓶純水。1 h后，取兩瓶水稱量。計算動物的糖水消耗、糖水偏愛（糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×l00%）；②曠場試驗：由不透明材料制成的76 cm× 76 cm×42 cm正方形敞箱，底面等分為25個等邊方格；晨7:30～12:00在安靜的房間內(nèi)觀察置于中心方格內(nèi)的大鼠5 min內(nèi)垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)。徹底清潔敞箱后進行下一只大鼠的觀察。藥物干預(yù)后1月再次進行上述指標(biāo)的觀察。

1.2.3 干預(yù)方法 制模后各組每日自由飲水、進食；造模第21天后正常對照組予生理鹽水10 mL/kg；氟西汀組每日8:00灌服氟西?。?.75 mg/kg）；CHSGS組每日8:00灌服2.7 g生藥/kg，連續(xù)1月。

1.2.4 藥物干預(yù)作用的評估 藥物干預(yù)1月后給予各組大鼠觀察藥物干預(yù)對糖水消耗及曠場試驗的影響。

1.2.5 BrdU免疫單標(biāo)記法給藥方式及免疫單標(biāo)記法 參考文獻[5]，Brdu細(xì)胞計數(shù)：400倍光鏡下觀察大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞層（granule cell layer，GCL）、顆粒下層增生帶（subgranular zone，SGZ，GCL邊緣與門區(qū)之間約2個細(xì)胞體厚的區(qū)域）Brdu陽性細(xì)胞數(shù)，每只大鼠隨機選取8個非連續(xù)的腦片進行記數(shù)，得出每張切片的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 癲癇模型制備結(jié)果

造模后10只大鼠死亡；造模成功94只，Racine分級為Ⅰ級3只、Ⅱ級2只、Ⅲ級3只、Ⅳ級18只、Ⅴ級68只。

2.2 癲癇合并抑郁模型大鼠的篩選結(jié)果

造模后第21天，根據(jù)糖水消耗、曠場試驗篩選出24只癲癇合并抑郁模型大鼠，其糖水消耗為（8.96±2.80）mL、糖水偏愛為（58.92±10.30）%、垂直運動次數(shù)為（7.56±3.30）次、水平運動次數(shù)為（16.89± 6.40）次，較正常對照組的糖水消耗、糖水偏愛、垂直運動次數(shù)、水平運動次數(shù)分別為（13.61±2.70）mL、（83.56±7.50）%、（21.56±2.12）次、（58.16±13.12）次，前者較后者明顯降低（<0.05）。將此24只大鼠隨機分為模型組、氟西汀組和CHSGS組。

2.3 干預(yù)1月后各組大鼠抑郁指標(biāo)比較

與模型組比較，氟西汀組、CHSGS組大鼠的糖水消耗、糖水偏愛、垂直及水平運動次數(shù)明顯提高（<0.05）；與正常對照組比較，模型組上述指標(biāo)明顯降低（< 0.05）；氟西汀組與CHSGS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 干預(yù)后各組大鼠糖水消耗、行為學(xué)評分的比較（±s）

表1 干預(yù)后各組大鼠糖水消耗、行為學(xué)評分的比較（±s）

注：與正常對照組比較，①<0.05；與模型組比較，②<0.05

正常對照組 8 14.68±2.50 84.85±9.50 22.55±2.50 58.87±11.40模型組 8 7.65±2.80① 55.12±13.70① 7.40±2.30① 19.47±6.20①氟西汀組 8 13.56±2.30② 82.13±10.20② 12.58±4.50② 53.13±8.10②CHSGS組 8 13.88±1.80② 81.55±11.10② 14.66±3.80② 52.50±9.80②

2.4 干預(yù)1月后各組大鼠海馬齒狀回新生神經(jīng)元的比較

正常對照組、模型組及氟西汀組、CHSGS組海馬齒狀回新生神經(jīng)元分別為（2.13±1.10）、（35.23±5.60）、（62.56± 13.20）、（65.13±12.30）個，與正常對照組比較，模型組、氟西汀組、CHSGS組海馬齒狀回新生神經(jīng)元顯著增加（<0.05）；與模型組比較，氟西汀組、CHSGS組海馬齒狀回新生神經(jīng)元顯著增加（<0.05）；氟西汀組與CHSGS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

圖1 4組大鼠海馬齒狀回BrdU標(biāo)記細(xì)胞（BrdU染色，×400）

3 討論

癲癇是一種由腦部神經(jīng)元高度同步化且常具有自限性的異常放電所導(dǎo)致的綜合癥。在我國，癲癇的患病率為3.6‰～7.0‰[6]，2010年活動性癲癇患者數(shù)量已達900多萬，而且每年以40萬的數(shù)量遞增。癲癇反復(fù)發(fā)作，治療時間長，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時給患者心理帶來不同程度的影響。許多患者存在明顯的心理、行為障礙。最近的一項Meta分析顯示[7]，癲癇伴發(fā)抑郁的發(fā)生率為23.1%，明顯高于普通人群的抑郁發(fā)生率，且抑郁的終身患病率達到13%。由此可見，癲癇與抑郁共病現(xiàn)象非常普遍。

雖然許多治療對無神經(jīng)系統(tǒng)疾病的抑郁有效，但是由于癲癇患者發(fā)生抑郁的機制尚不明確，這些療法對癲癇患者抑郁的有效性可能受到限制。有研究顯示，5-HT1A受體及神經(jīng)可塑性均與癲癇合并抑郁的發(fā)病機制密切相關(guān)[8]。近年來神經(jīng)干細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)成年靈長類和成人齒狀回和側(cè)腦室下區(qū)存在神經(jīng)發(fā)生[9]。資料顯示5-HT1A受體可能通過提高海馬區(qū)神經(jīng)可塑性改善癲癇抑郁癥狀[10]。Santarelli等[11]認(rèn)為慢性使用抗抑郁藥物通過5-HTRlA介導(dǎo)神經(jīng)元再生可能是SSRI類藥物的治療機制。因此筆者前期使用5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT對鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇合并抑郁復(fù)合大鼠模型進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)能夠改善癲癇合并抑郁大鼠模型的抑郁行為，提高海馬區(qū)新生神經(jīng)元生長等[12]。

雖然筆者發(fā)現(xiàn)5-HT1A受體激動能改善癲癇合并抑郁大鼠模型抑郁程度，但在臨床應(yīng)用中仍受到限制，可能是因為5-HT1A受體激動劑坦度螺酮臨床上多作為抗抑郁藥物增效劑使用[13]及目前的抗抑郁藥物（西藥）均有不同程度的毒副作用、成癮性及禁忌癥等缺陷。甚至某些抗抑郁藥會引起癲癇發(fā)作，例如三環(huán)類抗抑郁藥、安非他酮、氟西汀等[14]。中醫(yī)藥具有調(diào)節(jié)靶點多、毒副作用小、藥源廣泛等特點，是否在癲癇合并抑郁治療上具有優(yōu)勢是本研究關(guān)注的焦點?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明CHSGS治療癲癇及抑郁癥具有良好效果。CHSGS可促進海馬、杏仁核及額葉腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體酪氨酸受體激酶B水平升高[15]，上調(diào)海馬組織ERK1/2 mRNA的表達[16]，進而改善抑郁大鼠模型的抑郁癥狀。CHSGS還能下調(diào)大鼠海馬及額葉皮質(zhì)bax表達并上調(diào)bcl-2表達，抑制癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17]，從而起到良好的抗癲癇作用。因此本研究使用中藥復(fù)方CHSGS對鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇合并抑郁復(fù)合大鼠模型進行干預(yù)，并與氟西汀組進行比較，發(fā)現(xiàn)CHSGS組抑郁行為學(xué)指標(biāo)及新生神經(jīng)元數(shù)目與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明CHSGS可以調(diào)節(jié)癲癇合并抑郁大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生并改善抑郁癥狀。

本研究結(jié)果表明CHSGS可能是通過增加海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生來改善抑郁癥狀，因樣本量不足，實驗未設(shè)置中藥低高劑量組以及研究對它們之間是否通過5-HT1A受體起作用，需進一步探討。

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（本文編輯：王晶）

Effects of Chaihu-Shugan-San on Behavior and Neurogenesis of Hippocampal Dentate Gyrus

in Epileptic Rats with Depression

Chaihu-Shugan-San;epilepsy;depression;dentate gyrus;neurogenesis

R741;R749.05;R742.1

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.04.011AbstractObjective:To explore the effects of Chaihu-Shugan-San (CHSGS)on behavior and neurogenesis of the hippocampal dentate gyrus in chronic epileptic rats with depression.Methods:Twenty-four rats with depression which were selected from the chronic pilocarpine-induced epileptic rats were randomly divided into 3 groups(8 in each):the groups of model,Fluoxetine and CHSGS treatment.And the normal control group was established(n=8).After 21 d of pilocarpine-induced epilepsy in rats,the model group received saline(10 mL/kg), the Fluoxetine group was given Fluoxetine(0.75 mg/kg),and the CHSGS group was given CHSGS(2.7 g/kg)for 1 month.Saccharose water consumption test,open-field test and immunohistochemistry were used to observe the behavior and neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus.Results:when compared with those in the normal control group,the consumption of saccharose water and behavioral scores were significantly decreased whereas the number of newborn neurons in the hippocampal dentate gyrus were increased in the other three groups(< 0.05).The consumption of saccharose water,behavioral scores and numbers of newborn neurons in the hippocampal dentate gyrus were increased remarkably in the fluoxetine group and CHSGS group than than those in the model group (<0.05).There were no significant differences between the fluoxetine group and CHSGS group.Conclusion:CHSGS can increase the neurogenesis of the hippocampal dentate gyrus in epileptic rats with depression and effectively improve behavior recovery.

1.湖南省腦科醫(yī)院精神科長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所長沙 410208；3.山西醫(yī)科大學(xué)附一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科太原 030001

山西省歸國人員基金（2008-52）

2014-03-18

李亮superliliang@126. com