響應面法優(yōu)化葡萄葉中白藜蘆醇的提取條件

毛俊霞，張文君，李曦默，孫雅茹，楊建雄

陜西師范大學生命科學院，西安 710062

白藜蘆醇(resveratrol)最初作為植物抗菌素而被發(fā)現(xiàn)的，是植物產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物。其分子式為C14H12O3，相對分子質(zhì)量為228.25，難溶于水，易溶于有機溶劑，廣泛存在于21個科、31個屬的72 種植物中［1］，如寥科的寥屬、大黃屬，葡萄科的葡萄屬和爬山虎屬，百合科的藜蘆屬，莎草科的苔屬，?？频纳伲箍频穆浠ㄉ鷮?、羊蹄甲屬和決明屬等多種植物［2］。常見的含白藜蘆醇的植物有決明子、何首烏和虎杖等傳統(tǒng)藥用植物，近來報道在葡萄、花生和桑樹等中也含有一定量的白藜蘆醇。白藜蘆醇具有多種藥理活性，如抗菌消炎抗病毒抗氧化、保護心血管系統(tǒng)、肝臟和神經(jīng)元、調(diào)節(jié)免疫和骨代謝，并對癌癥具有預防和治療作用，被認為是繼紫杉醇之后的又一抗癌成份［1-3］。

在葡萄的不同組織部位，如葡萄皮、葡萄籽、葡萄果穗軸和葡萄葉中均含有白藜蘆醇［4］。而我國葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)達，每年秋季丟棄的葡萄葉數(shù)量可觀，充分利用葡萄葉資源提取白藜蘆醇，優(yōu)選出低成本的提取方法，便可以變廢為寶，為葡萄資源的合理利用開辟新途徑，但尚未見到以葡萄葉為原料提取白藜蘆醇工藝條件的研究報道。響應面法(RSM)是評價指標和因素間的非線性關系的一種試驗設計方法，通過合理的試驗設計得到的一定數(shù)據(jù)，建立影響因素與響應值之間的多元二次回歸模型，通過對回歸方程的分析來優(yōu)化工藝參數(shù)［5，6］。本文以乙醇為浸提劑，以葡萄葉為原料，白藜蘆醇提取量為考察目標，在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法優(yōu)化提取條件，為利用葡萄葉提取白藜蘆醇提供實驗數(shù)據(jù)，以促進葡萄葉資源的更好開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戶太八號葡萄葉，采自西安市長安區(qū)灤鎮(zhèn)葡萄園(陰干，粉碎，備用);白藜蘆醇對照品，購自中國生物制品檢定所(批號:100080-200707);乙酸乙酯和無水乙醇為分析純，甲醇和乙腈為色譜純。

1.2 儀器與設備

LC-2010 AHT 型高效液相色譜儀(日本島津);BP221S 電子天平(Sartorius 公司);KQ-300DE 型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠);Milli-Q Century 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司)。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇的提取方法

稱取一定量粉碎的葡萄葉片，按所設定的單因素條件浸提，提取液過濾，濾液回收溶劑并濃縮至一定體積。將該濃縮液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，萃取3 次，每次乙酸乙酯液的使用量以1∶1 計，將上層的有機相收集并合并。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯，殘留物用甲醇溶解并定容至5 mL，用微孔濾膜(φ=0.45 μm)過濾，得樣品溶液。因白藜蘆醇對光敏感，該過程需避光。

1.3.2 白藜蘆醇的含量測定方法

采用高效液相色譜法(HPLC)測定樣品中白藜蘆醇的含量，色譜柱為Hypersil C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相為水(A)和乙腈(B);洗脫程序:0～5 min，15%～24%(B);

5～33 min，24%～40%(B);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為306 nm。

1.3.3 標準曲線的繪制

準確稱取白藜蘆醇對照品5.1 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配成質(zhì)量濃度為0.204 mg/mL 的對照品儲備液。準確吸取上述白藜蘆醇對照品儲備液1 mL，稀釋成20.4 μg/mL 對照品溶液。準確吸取上述對照品溶液，分別以5、10、15、20、25 和30 μL 的不同體積進樣。在上述色譜條件下進行分析，以峰面積Y 為縱坐標，進樣量X(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=7 ×106X-19421(r2=0.9996)，表明進樣量在0.1～0.6 μg 范圍內(nèi)，白藜蘆醇含量與峰面積具有良好的線性關系。

1.3.4 方法學考察

在相同的色譜條件下，考察精密度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率等指標，計算相對標準偏差(RSD)。

1.4 實驗設計與數(shù)據(jù)分析

1.4.1 單因素實驗

在進行響應面分析之前，先通過單因素實驗選出對白藜蘆醇提取量具有明顯影響的因素并確定其試驗水平。稱取5.0 g 葡萄葉，考查了不同的乙醇體積分數(shù)、液固比、浸提時間、浸提溫度和提取次數(shù)等對白藜蘆醇提取量的影響。

1.4.2 響應面分析法優(yōu)化提取條件

在單因素實驗的基礎上，通過分析軟件Design Expert V 8.05 b 設計響應面分析法的實驗方案，對葡萄葉中白藜蘆醇的提取工藝作進一步的優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法學考察結果

按1.3.2 的含量測定方法得到對照品和樣品的色譜圖，如圖1 所示。

精密度試驗:取20 μg/mL 的白藜蘆醇對照品溶液重復進樣5 次，記錄峰面積，計算得RSD 為0.7%(n=5)，說明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:同一待測樣品，在HPLC 中每隔2 h 測定1 次，共5 次，記錄白藜蘆醇的峰面積，計算得RSD 為3.17%(n=6)，說明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗:在相同的條件下，以同一葡萄葉制備5 份樣品，在相同的HPLC 條件下檢測白藜蘆醇，由峰面積計算出RSD 為2.48%(n=5)說明該方法重復性好。

圖1 白藜蘆醇對照品(A)和葡萄葉提取物(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of resveratrol standard(A)and grape leaves extract(B)

加樣回收率實驗:準確稱取干燥的葡萄葉5 份，每份以1∶1 的比例加入白藜蘆醇對照品，按1.3.1的方法制備樣品，在相同的HPLC 條件下檢測，計算得平均回收率為102.09%，RSD 為3.27%(n=5)，說明該方法的準確度好。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)

稱取4 份葡萄葉，按照20 倍體積分別加入30%、40%、50%和60%的乙醇溶液，于室溫在300 W 的功率下超聲處理30 min 后，于60 ℃水浴浸提60 min。所得提取液按1.3.1 方法操作后，用HPLC測定白藜蘆醇的含量，結果如圖2。由圖可知:白藜蘆醇含量隨乙醇體積分數(shù)的升高而增大，當乙醇體積分數(shù)為40%和50%時，白藜蘆醇含量較高;當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)升高時，白藜蘆醇含量反而減小。原因可能是:隨乙醇體積分數(shù)增加，醇溶性雜質(zhì)和親脂性成分的溶出量增加，影響了白藜蘆醇與溶劑分子的結合，導致白藜蘆醇提取量下降。綜合考慮，選擇體積分數(shù)為40%的乙醇作為提取劑。

圖2 乙醇體積分數(shù)對白藜蘆醇含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of resveratrol

2.2.2 液固比

稱取3 份葡萄葉，分別按照15、20 和25 倍的體積加入60%的乙醇溶液，于室溫在300 W 的功率下超聲處理30 min 后，于60 ℃水浴浸提60 min。所得提取液按1.3.1 方法操作后，用HPLC 測定白藜蘆醇的含量，結果如圖3。由圖可知:隨液固比的增加，白藜蘆醇含量在增加，但液固比大于20 mL/g時，白藜蘆醇含量增加緩慢。因此，選擇20 mL/g 為最佳液固比。

圖3 液固比對白藜蘆醇含量的影響Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on extraction yield of resveratrol

2.2.3 浸提時間

稱取3 份葡萄葉，按照20 倍的體積加入60%的乙醇溶液，于室溫在300 W 的功率下超聲處理30 min 后，于60 ℃水浴分別浸提30、60 和90 min。所得提取液按1.3.1 方法操作后，用HPLC 測定白藜蘆醇的含量，結果如圖4。由圖可知:隨著時間的增加，白藜蘆醇含量也增加，在60 min 時達到最大，時間繼續(xù)增加，白藜蘆醇含量卻下降。這可能是由于提取時間為60 min 時，白藜蘆醇已經(jīng)較完全地溶出。由于白藜蘆醇的熱敏性較強，浸提時間延長后其分解速率超過溶出速率，從而導致白藜蘆醇含量下降。因此，選擇60 min 為最佳提取時間。

圖4 提取時間對白藜蘆醇含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of resveratrol

2.2.4 浸提溫度

稱取3 份葡萄葉，按照20 倍的體積加入60%的乙醇溶液，于室溫在300 W 的功率下超聲處理30 min 后，分別于50、60 和70 ℃水浴浸提60 min。所得提取液按1.3.1 方法操作后，用HPLC 測定白藜蘆醇的含量，結果如圖5。由圖可知:在40～60 ℃之間，隨著溫度的升高，白藜蘆醇含量增加，60 ℃時效果最佳，溫度繼續(xù)升高時，白藜蘆醇含量又會下降。這可能是由于白藜蘆醇對熱敏感，溫度過高會導致其分解。因此，選擇60 ℃為最佳提取溫度。

圖5 浸提溫度對白藜蘆醇含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction yield of resveratrol

2.2.5 提取次數(shù)

稱取4 份葡萄葉，按照20 倍的體積加入60%的乙醇溶液，于室溫在300 W 的功率下超聲處理30 min 后，于60 ℃水浴浸提60 min，分別提取1、2、3和4 次。所得提取液合并后按1.3.1 方法操作后，用HPLC 測定白藜蘆醇的含量，結果如圖6。由圖可知:隨提取次數(shù)的增加，白藜蘆醇的提取量逐漸增加，當提取3 次后，白藜蘆醇含量增加不明顯。綜合考慮后，確定提取次數(shù)為3 次。

圖6 提取次數(shù)對白藜蘆醇含量的影響Fig.6 Effect of times of extraction on yield of resveratrol

2.3 響應面分析實驗結果

在上述的單因素試驗中，提取時間對白藜蘆醇含量的影響較明顯，且大部分文獻報道的提取時間也在60 min;通常，目標物質(zhì)的提取量會隨提取次數(shù)增加而增加，故在運用響應面方法優(yōu)化時，未考慮提取時間和提取次數(shù)這2個因素。響應面法的實驗設計如表1，選取的自變量為乙醇體積分數(shù)(A)、液固比(B)和浸提溫度(C)，提取得到的白藜蘆醇含量為響應值(Y)，響應面試驗的方案及結果如表2。

表1 響應面法的因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM

對表2 的數(shù)據(jù)用分析軟件Design Expert V 8.05 b 處理，得到如下的多元二次方程:Y=45.88 +4.10A+1.70B+0.49C+0.63AB-0.13AC +1.62BC-4.06A2-2.01B2-3.61C2。

式中:各項系數(shù)的絕對值大小反應各因素對響應值(Y)的影響程度，系數(shù)的正負則反映了影響的方向［7，8］。

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Results of response surface experiments

表3 為響應面法試驗數(shù)據(jù)的方差分析。統(tǒng)計顯示:所建模型的F 值為63.74，反映顯著性的P 值小于0.0001，即該模型極顯著(P＜0.01)，對實驗因素的擬合情況較好，可很好地描述實驗結果;失擬性分析的F 值為1.36，P 值為0.3759(P ＞0.05)，即失擬不顯著，這表明未知因素對試驗結果的干擾很小。模型的變異系數(shù)CV 值較小，僅1.83，說明該模型的可信度高，穩(wěn)定性好，調(diào)整決定系數(shù)表示97.24%的響應值差異可由該模型解釋，即該模型的相關性很好，可用該模型對白藜蘆醇的提取過程進行分析和預測［6］。

各變量對響應值的影響大小，是由F 檢驗來判定的。概率P 值＞F 的值越小，則相應變量對響應值影響的顯著程度越高。由表3 可以看出:一次項中，液固比和乙醇體積分數(shù)對響應值的作用達到極顯著的水平(P＜0.01)，浸提溫度的作用不顯著(P＞0.05);二次項中，浸提溫度、液固比和乙醇體積分數(shù)對響應值的作用均達到極顯著水平(P＜0.01);在交互項中，液固比和浸提溫度的交互作用極顯著(P＜0.01)，其余因素間的交互作用不顯著(P ＞0.05)，故不能用簡單的線性關系表示所選實驗因素對響應值的影響。在實驗范圍內(nèi)，各因素對響應值的影響大小為:乙醇體積分數(shù)＞液固比＞浸提溫度。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

各因素交互作用對響應值的影響，如圖7 所示。響應面圖為三維空間曲面，是根據(jù)回歸方程繪制的。分析發(fā)現(xiàn):所有三維曲面的開口均向下，向上形成凸面，在一定的范圍內(nèi)，因素值增大引起響應值升高，響應值增加至最大值后，因素值的增大又導致響應值逐漸降低，故響應值的最高點即為所建模型的穩(wěn)定點［9］。

圖7 各因素交互作用對白藜蘆醇提取量影響的響應圖Fig.7 Response surface plots showing interactive effects of different factors on extraction yield of resveratrol

在底面上，響應值相同的點對應的因素值可形成等高線。交互作用的強弱可由其形狀反映出來。當所考察因素的交互作用弱時，等高線接近圓形;當兩作用因素的交互作用強時，等高線呈現(xiàn)為橢圓形［10］。觀察各等高線，可發(fā)現(xiàn)液固比和浸提溫度的交互作用強，為極顯著;其余各因素的交互作用均不顯著。

用分析軟件Design Expert V 8.05 b 分析實驗數(shù)據(jù)后，得出白藜蘆醇的優(yōu)化提取條件為:在61.9 ℃時，選擇45.5%的乙醇，以22.95 mL/g 的液固比加入溶劑。選用上述優(yōu)化的提取工藝，分析軟件預測白藜蘆醇提取量為47.55 μg/g。在實際提取過程中，將優(yōu)化的提取方法近似為:乙醇體積分數(shù)為46%，液固比為23 mL/g，溫度為62 ℃。

2.4 響應面法工藝驗證實驗結果

運用優(yōu)化的提取方法平行制取3 份樣品，以驗證響應面法所建立的模型。HPLC 測得的白藜蘆醇提取量為47.96 μg/g(RSD=2.55%)。與回歸模型的預期相比，其相對誤差只有0.86%，說明該模型可靠性好，所預測的結果準確，可用于分析和預測各因素對白藜蘆醇提取量的影響。

3 結論

本文在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對葡萄葉中白藜蘆醇提取條件進行優(yōu)化。該方法優(yōu)化的白藜蘆醇最佳提取條件為:在62 ℃的溫度下，選擇46%的乙醇，以23 mL/g 的液固比加入溶劑?；貧w分析和驗證實驗表明:該工藝條件提取率高，穩(wěn)定性好，操作簡便。

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