陽(yáng)春砂多糖的分離純化及體外抗氧化作用研究

李世杰，張丹雁，嚴(yán)婭娟，曹 曼

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006

陽(yáng)春砂來(lái)源于姜科豆蔻屬植物陽(yáng)春砂(Amomum villosum Lour.)的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)著名的“四大南藥”之一。具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，臨床上主要用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動(dòng)不安等癥［1］。

近年來(lái)，大量學(xué)者從植物、微生物中提取多糖并進(jìn)行相關(guān)藥理研究，取得了巨大的成果。目前研究表明，多糖具有抗炎、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降低血壓等功效［2-6］。然而，陽(yáng)春砂多糖(Amomum villosum polysaccharides，以下簡(jiǎn)稱AVP)的藥理活性研究還尚未見報(bào)導(dǎo)，目前針對(duì)陽(yáng)春砂的藥理研究主要集中在其水提液及揮發(fā)油研究上，單純研究水提液的藥理作用不能闡明其具體作用機(jī)制，無(wú)法給出合理科學(xué)的解釋，而陽(yáng)春砂水提液中主要成分為水溶性多糖，因此，對(duì)AVP 初步藥理活性研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文以AVP 及其純化組分為研究對(duì)象，比較其對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基及二苯代苦味肼基自由基的清除作用，以了解AVP 抗氧化作用活性，為陽(yáng)春砂的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

陽(yáng)春砂，采自陽(yáng)春市砂仁種植場(chǎng)，樣品經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定為姜科植物陽(yáng)春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實(shí);乙醇(AR，上海久億試劑公司)，硫酸(AR，上海久億試劑公司)，正丁醇(AR，南京試劑公司)，氯仿(AR，南京試劑公司);DEAE-纖維素-52 凝膠、SephadexG-100 凝膠、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基苦基苯肼、菲咯嗪、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、吩嗦硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶I(NADH)、三吡啶吖嗪(TPTZ)購(gòu)于Sigma 公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

KQ-400KDE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA2004 電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司);501-A 型超級(jí)恒溫器(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司);DL-6000B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);UV-360 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);DHL-2B 型電腦數(shù)顯恒流泵、DBS-100A 型電腦全自動(dòng)部份收集器(上海滬西分析儀器廠);層析柱(2.6 ×30 cm，2.6 ×60 cm，上海亞榮生化儀器有限公司);Alphal-2 型冷凍干燥機(jī)(英國(guó)LABCONCO 公司);Re-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(金壇市玻璃實(shí)驗(yàn)廠)。后得到三個(gè)主要組分，分別為純水洗脫的組分Fl、0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫的組分F2和0.3 mol/L NaCl 溶液洗脫的組分F3。

圖1 AVP DEAE-纖維素-52 色譜柱洗脫曲線圖Fig.1 DEAE-cellulose-52 column elution curve of AVP

2 方法與結(jié)果

2.1 AVP 分離純化

2.1.1 AVP 樣品制備

采用水提醇沉法［7］得到粗多糖AVP 樣品。

2.1.2 離子交換色譜法初步分離

稱取60 mg AVP 粗多糖溶于3 mL 去離子水中，加樣于DEAE-纖維素-52 層析柱(2.6 ×30 cm)中，用0.0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液依次梯度洗脫，流速1.0 mL/min，分步收集(10 min/管)，每梯度20 管，硫酸-苯酚法檢測(cè)各管多糖含量(490 nm處吸收值)，收集不同洗脫梯度相應(yīng)的組分。合并相同組分，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析48 h以去除NaCl 及小分子雜質(zhì)，最后將透析液真空冷凍干燥，得初步純化產(chǎn)品。同時(shí)以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)、吸光值(490 nm)為縱坐標(biāo)繪制DEAE-纖維素-52 色譜柱洗脫曲線，洗脫曲線見圖1。由圖1 可以看出，陽(yáng)春砂多糖經(jīng)DEAE-纖維素-52 層析柱分離

2.1.3 葡聚糖凝膠色譜法進(jìn)一步純化

分別稱取10 mg 經(jīng)DEAE-纖維素-52 初步純化的各多糖組分，溶于5 mL 去離子水中，加樣于Sephadex G-l00 層析柱(2.6 ×60 cm)中，用去離子水洗脫，流速0.25 mL/min，分步收集(10 min/管)。硫酸-苯酚法檢測(cè)各管多糖含量(490 nm 處吸收值)，分別收集不同的組分。合并相同組分，50 ℃減壓蒸發(fā)濃縮，去離子水透析48 h 以去除小分子雜質(zhì)，最后將透析液真空冷凍干燥，得純化產(chǎn)品用于進(jìn)一步的分析。同時(shí)以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)、吸光值(490 nm)為縱坐標(biāo)繪制Sephadex G-100 色譜柱洗脫曲線，洗脫曲線見圖2。從圖2 可以看出，初步分離的三個(gè)組分(F1、F2和F3)經(jīng)葡聚糖G-100 凝膠柱分離后各得一個(gè)純化組分，分別命名為AVP-1、AVP-2 和AVP-3。多糖組分由于存在糖醛酸、硫酸基等一些荷電基團(tuán)，因此要想獲得純多糖，通常先按照離子強(qiáng)度的不同進(jìn)行初步分離，得到電荷單一的組分，然后再通過(guò)分子量的不同進(jìn)行第二次分離獲得電荷和分子量均單一的多糖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化陽(yáng)春砂多糖，得到了三個(gè)純化組分(AVP-1、AVP-2 和AVP-3)，用于進(jìn)一步的分析。

圖2 AVP Sephadex G-100 色譜柱洗脫曲線圖Fig.2 Sephadex G-100 column elution curves of AVP

2.2 AVP 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 多糖對(duì)超氧陰離子自由基(O-·2)的清除作用

采用超氧陰離子自由基體系［8］，觀察多糖對(duì)的清除作用。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于試管中，分別加入1.0 mL NBT 溶液(156 μmol/L)、1.0 mL NADH 溶液(468 μmol/L)和1.0 mL PMS 溶液(60 μmol/L)?；靹蚍磻?yīng)體系，25 ℃水浴5 min，于560 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。NBT 溶液、NADH 溶液及PMS 溶液都是用0.1 M pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液配制。以水代替AVP、維生素C 溶液;0.1 M pH=7.4 磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。每個(gè)試樣做3次平行試驗(yàn)取平均值。清除率計(jì)算公式為:

式中:A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(水代替AVP、維生素C溶液)的吸光度;A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度;A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)(0.1M pH=7.4 磷酸鹽緩沖液代替NBT 溶液)的吸光度。

不同濃度的AVP 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用結(jié)果見圖3。由圖3 可知，AVP 及其純化組分AVP-1、AVP-2、AVP-3 對(duì)自由基清除活性呈一定的量效關(guān)系。AVP-3 清除活性稍高于粗AVP、AVP-1 及AVP-2。當(dāng)濃度高于1 mg/mL 時(shí)，多糖清除活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照品維生素C。

圖3 陽(yáng)春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除活性Fig.3 Scavenging effects of AVP and its purified fractions(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on superoxide radical

2.2.2 多糖對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用

羥基自由基清除活性的測(cè)定參照Yang 等［9］報(bào)道的方法稍作修改。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)溶液1.0 mL 于試管中，分別加入2.4mL 磷酸鹽緩沖液(0.1M pH=7.4)和0.6 mL H2O2溶液(40 mmol/L)?；靹蚍磻?yīng)體系，10 min 后于分光光度計(jì)230 nm處測(cè)吸光度，以水代替AVP、維生素C 溶液和H2O2溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。每個(gè)試樣做3 次平行試驗(yàn)取平均值，清除率計(jì)算公式同式1。

不同濃度的AVP 對(duì)羥基自由基的清除作用結(jié)果見圖4。由圖4 可知，AVP 及其純化組分對(duì)·OH自由基具有明顯的清除活性。AVP-3 清除·OH 自由基活性最強(qiáng)，當(dāng)其濃度達(dá)到3.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH自由基清除率為68.2%。但是AVP 及其純化組分對(duì)·OH 自由基清除活性比陽(yáng)性對(duì)照品要弱。

圖4 陽(yáng)春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除·OH 活性Fig.4 Scavenging effects on hydroxyl radical of AVP and its purified fraction (AVP-1，AVP-2 and AVP-3)

2.2.3 多糖對(duì)1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)

DPPH·自由基清除活性的測(cè)定參照Li 等［3］報(bào)道的方法稍作修改。取不同濃度的AVP 樣品(粗AVP、AVP-1、AVP-2 和AVP-3)及維生素C 溶液(0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 及5.0 mg/mL)1.0 mL 于試管中，分別加入0.2 mL DPPH 溶液(0.4 mmol/L)，再加入2.0 mL 水?；靹蚍磻?yīng)體系，30 min 后于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)吸光度。DPPH 溶液用無(wú)水乙醇配制。以水代替AVP、維生素C 溶液，無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，作空白實(shí)驗(yàn)調(diào)零用。每個(gè)試樣做3 次平行試驗(yàn)取平均值。清除率計(jì)算公式同式1。

圖5 陽(yáng)春砂多糖及其純化組分(AVP-1、AVP-2、AVP-3)清除DPPH·活性Fig.5 Scavenging effects of AVP and its purified fraction(AVP-1，AVP-2 and AVP-3)on DPPH radical

不同濃度的AVP 對(duì)DPPH·的清除作用結(jié)果見圖5，圖5 表明AVP 及其純化組分對(duì)DPPH·都具有一定的清除活性。AVP-1 對(duì)DPPH·的清除作用最弱，AVP-3 清除活性最強(qiáng);當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，AVP-3 對(duì)DPPH·的清除作用基本與陽(yáng)性對(duì)照品相同。

3 結(jié)論

植物來(lái)源的多糖類化合物擁有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的獨(dú)特功能，而且大多數(shù)毒性較小，在預(yù)防疾病上優(yōu)于其他化合物，因此其應(yīng)用具有廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)以陽(yáng)春砂粗多糖AVP 及純化后的組分AVP-1、AVP-2、AVP-3 為研究對(duì)象進(jìn)行抗氧化活性研究，確證了陽(yáng)春砂多糖具有抗氧化的作用，它們具有很好的清除超氧陰離子自由基()、羥基自由基(·OH)及1，1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)活性，AVP-3比粗AVP、AVP-1 及AVP-2 具有更強(qiáng)的體外抗氧化活性。AVP 及其純化組分對(duì)超氧陰離子自由基)清除活性要顯著優(yōu)于維生素C。陽(yáng)春砂多糖的藥理活性目前尚未有深入研究，本實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)春砂相關(guān)藥品及食品研究開發(fā)提供的新的研究思路，為陽(yáng)春砂的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

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