亞抑制濃度抗生素對(duì)細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展

丁曼琳，陳文碧，張菲陽 綜述 周英順 審校

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 檢驗(yàn)科（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原教研室（瀘州 646000）

近年來，抗生素耐藥性在全球范圍內(nèi)構(gòu)成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅[1]。編碼β-內(nèi)酰胺酶的抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）如blaKPC、blaCTX和blaOXA等，已在各種環(huán)境中檢測(cè)到，包括河流[2-3]、海水[4]、污水[5-7]、土壤[8-9]、醫(yī)院環(huán)境[10]等，使細(xì)菌獲得對(duì)大多數(shù)青霉素類和頭孢菌素類抗生素的耐藥性，對(duì)人類健康危害極大。

1928 年，格里菲斯（Griffith）首次描述了水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）的現(xiàn)象[11]，并發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌獲得外源DNA的一種方式。HGT由轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合這3 種不同的機(jī)制介導(dǎo)。ARGs 的水平轉(zhuǎn)移是加速環(huán)境中抗生素耐藥性形成和富集的主要原因之一，基因的轉(zhuǎn)移不僅可以發(fā)生在同源細(xì)菌之間，也可以發(fā)生在革蘭陽性與革蘭陰性細(xì)菌之間，甚至發(fā)生在不同域之間，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題日漸嚴(yán)峻[12-13]。

高濃度的抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，而亞抑制濃度的抗生素作為細(xì)菌通訊和信號(hào)的媒介，改變細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄代謝水平。例如，亞抑制濃度可以誘導(dǎo)一系列基因表達(dá)譜發(fā)生改變，如氧化應(yīng)激、動(dòng)力、毒力和生物膜形成能力[14]，在抗生素耐藥性和致病性中起著關(guān)鍵作用。目前，有研究報(bào)道細(xì)菌在亞抑制濃度抗生素下會(huì)增加水平基因轉(zhuǎn)移頻率，故本文從耐藥基因傳播的角度出發(fā)，闡明亞抑菌濃度抗生素對(duì)細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移的影響。

1 亞抑制濃度抗生素定義及來源

抗生素主要用于治療致病菌，其殘留物也可以釋放到環(huán)境中，例如污水。通常，環(huán)境中抗生素的濃度很低，在ng/L 范圍內(nèi)[15-16]，這些低濃度的抗生素并不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，被稱為亞抑制濃度（sub-minimum inhibitory concentration，sub-MIC）。

在抗生素的臨床應(yīng)用中，需要結(jié)合藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)給藥，并使抗生素濃度大于最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，感染部位抗生素的濃度往往低于MIC，原因有以下幾點(diǎn)：藥物動(dòng)力學(xué)因素導(dǎo)致在組織器官中達(dá)不到MIC 濃度、藥物-藥物相互作用[17]、不規(guī)范用藥[18]、細(xì)菌形成生物膜抵御抗生素[19]、病人的某些臨床或健康狀況可能導(dǎo)致抗生素在體循環(huán)中的生物利用度降低，從而可能導(dǎo)致抗生素的亞治療水平。在畜牧業(yè)中，抗生素在動(dòng)物疾病預(yù)防和治療中起著重要作用，亞抑制濃度的抗生素還被用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑（as growth promoters，AGPs），可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。

2 亞抑制濃度抗生素對(duì)水平基因轉(zhuǎn)移的影響

目前，國(guó)內(nèi)外也有很多研究表明亞抑制濃度可以促進(jìn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。亞抑制濃度的環(huán)丙沙星和左氧氟沙星處理供體菌8 h后，均可顯著促進(jìn)大腸桿菌RP4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌的接合頻率，且呈劑量依賴性[20]。最近的研究表明，0.001 μg/mL的亞濃度四環(huán)素（1/150×MIC）處理后，接合轉(zhuǎn)移頻率增加了約4倍，說明亞抑制濃度的四環(huán)素可以促進(jìn)抗生素耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[21]。鄂順梅[22]等人發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌經(jīng)1/16 ×MIC-1/256×MIC濃度的環(huán)丙沙星處理后，與對(duì)照組相比，接合頻率均升高，其中1/256×MIC 處理組升高1.5倍，接合頻率升高趨勢(shì)與本研究相似：隨著亞抑制濃度的降低，接合頻率逐漸升高。

目前，在腸道中的HGT 報(bào)道較少。腸道是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，宿主提供源源不斷的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持腸道微生物群的活躍代謝；其種群密度極高[23]，有利于細(xì)菌之間密切接觸，為HGT創(chuàng)造條件；還有腸道菌群的多樣性[24]，這些條件使細(xì)菌能夠交換遺傳物質(zhì)，包括耐藥基因和毒力基因，以適應(yīng)腸道中的不利條件[25]，所以動(dòng)物腸道越來越被認(rèn)為是細(xì)菌交換遺傳物質(zhì)的“熔爐”[26]。ZHANG 等報(bào)道環(huán)丙沙星可以增強(qiáng)志賀毒素的腸內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。G?TTIG 等研究了耐藥基因blaOXA-48在大蠟螟和小鼠體內(nèi)的接合轉(zhuǎn)移頻率，結(jié)果表明，體外接合頻率為8.7×10-7，在大蠟螟體內(nèi)接合頻率為1.3×10-4，高出體外接合頻率149.425倍，在小鼠腸道內(nèi)接合頻率為2.9 × 10-5，高出體外接合頻率33.333 倍[28]。有大量的證據(jù)表明，在實(shí)驗(yàn)條件下的動(dòng)物腸道內(nèi)，抗生素的亞抑制作用可能顯著增加水平基因轉(zhuǎn)移的頻率[29]。

但是到目前為止，HGT是如何在腸道中發(fā)生的，特別是在腸道中影響HGT 效率的體內(nèi)因素方面，仍有很大程度上的未知。我們對(duì)腸道內(nèi)HGT的了解主要建立在廣泛的體外研究上，如果有一種特定抗生素被證明可以極大地提高HGT 在腸道的效率，特別是可以通過不同的HGT通路（接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化）傳播耐藥基因，建議在食用動(dòng)物中限制該抗生素的使用，可以減少耐藥基因傳播和多重耐藥病原體出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。

3 亞抑制濃度抗生素影響接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制

3.1 SOS應(yīng)答

SOS 反應(yīng)是由lexA 和recA 基因調(diào)控的，是一種由DNA 損傷引發(fā)的、誘導(dǎo)DNA 修復(fù)和突變的應(yīng)激反應(yīng)[30]。SOS 反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄通常受到抑制。在染色體損傷時(shí)，暴露的單鏈DNA 可以吸引RecA 形成核蛋白絲，而核蛋白絲通過促進(jìn)LexA 阻遏物的分裂激活SOS基因的表達(dá)[31]。

目前，已知的幾種抗生素（氟喹諾酮類[32]、β-內(nèi)酰胺類[33-34]和甲氧氨芐嘧啶[35]）可誘發(fā)SOS應(yīng)答并增加細(xì)菌的突變頻率。此外，ELISA 等發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺抗生素通過激活SOS應(yīng)答增加金黃色葡萄球菌毒力島基因的復(fù)制和在群體中的傳播能力[36]。環(huán)丙沙星可導(dǎo)致志賀毒素編碼噬菌體誘導(dǎo)并增強(qiáng)大腸桿菌O157：H7的志賀毒素的水平轉(zhuǎn)移[27]。通過接合和基因表達(dá)分析，BEABER等證明，使用SOS誘導(dǎo)劑絲裂霉素C和喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星誘導(dǎo)SOS 反應(yīng)，可以顯著增強(qiáng)大腸桿菌和霍亂弧菌的ICE轉(zhuǎn)移（300倍）[37]。

3.2 ROS產(chǎn)生

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在許多生理和病理過程中扮演重要角色。近年的研究發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度的抗生素介導(dǎo)積累的ROS 可通過誘導(dǎo)MarA和SoxS提高細(xì)菌耐藥、耐受性的產(chǎn)生[38-39]。HAN[40]等發(fā)現(xiàn)亞抑制濃度的季銨鹽類化合物增強(qiáng)了細(xì)菌的膜通透性，刺激細(xì)菌產(chǎn)生ROS，這可能促進(jìn)了質(zhì)粒在細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移。LU[41]等發(fā)現(xiàn)三氯生可以觸發(fā)ROS從而促進(jìn)細(xì)菌之間的ARGs 接合轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)提高了我們對(duì)抗生素耐藥性傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)。

3.3 群體感應(yīng)

群體感應(yīng)是一種細(xì)菌密度依賴性現(xiàn)象，是通過細(xì)菌向細(xì)胞外環(huán)境中產(chǎn)生和釋放信號(hào)分子（自誘導(dǎo)劑）介導(dǎo)的[42-43]。最近的研究也表明，一些涉及群體感應(yīng)的微生物衍生因子可以促進(jìn)HGT。

質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移也受群體感應(yīng)的調(diào)控，亞抑制濃度的四環(huán)素可以促進(jìn)RP4 質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，這一過程可以被群體感應(yīng)激動(dòng)劑促進(jìn)，也可被群體感應(yīng)抑制劑抑制。LU[44]等發(fā)現(xiàn)AHLs-SdiA化學(xué)信號(hào)具有抑制接合轉(zhuǎn)移的作用，群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因sdiA的缺失促進(jìn)了tral基因mRNA的表達(dá)。細(xì)菌信息素是與群體感應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)的分泌肽，也通過細(xì)胞間信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移。由于信息素在腸內(nèi)腸球菌中普遍存在，群體感應(yīng)可能在腸道內(nèi)腸球菌間的HGT 中起重要作用[45]。

4 小結(jié)

抗生素的亞抑制濃度增強(qiáng)接合頻率已經(jīng)是細(xì)菌中普遍存在的現(xiàn)象。本文從SOS 應(yīng)答，ROS 產(chǎn)生和群體感應(yīng)三方面闡述亞抑制抗生素壓力介導(dǎo)質(zhì)粒接合頻率的機(jī)制，有助于我們進(jìn)一步掌握耐藥基因傳播機(jī)制，對(duì)緩解耐藥基因傳播具有重要的臨床意義。

（利益沖突：無）