Bcl-2與Ki-67蛋白在喉鱗癌中的表達(dá)檢測(cè)及臨床相關(guān)性分析

謝金龍，羅招陽(yáng)，袁恩健，陳永春，左建宏(.解放軍第一六九中心醫(yī)院 腫瘤科，湖南 衡陽(yáng) 400；.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所)

喉鱗癌是頭頸部最常見(jiàn)的鱗狀細(xì)胞癌[1]，是僅次于肺癌的第二大呼吸道惡性腫瘤，是全球第六位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例數(shù)超過(guò)50萬(wàn)，近30年來(lái)死亡率仍較高[2]，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，因此對(duì)喉鱗癌進(jìn)行深入研究具有十分重要的意義。

惡性腫瘤發(fā)生的過(guò)程是基因的多階段的損傷積累的結(jié)果，Bcl-2是原癌基因，其腫瘤組織中常表達(dá)異常[3]。Bcl-2高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，有利于變異基因的積累，增加了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。無(wú)限增殖是癌細(xì)胞的重要特征之一，而Ki-67是細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)[4]，能反映惡性腫瘤增殖率，其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記。而抗凋亡家族的Bcl-2蛋白和核增殖Ki-67蛋白在喉鱗癌中的表達(dá)及二者表達(dá)相關(guān)性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究的目的主要是檢測(cè)喉鱗癌組織和正常喉粘膜組織的中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達(dá)，分析其與喉鱗癌的臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討兩者之間的相關(guān)性，為喉鱗癌患者的早期診斷、轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為喉鱗癌的靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2013年12月術(shù)前未經(jīng)放療、化療的喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除存檔的病理標(biāo)本54例，男44例，女10例，年齡37～76歲，平均年齡62.4歲，大于60歲有29例，小于60歲有25例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷和免疫組化證實(shí)為喉鱗狀細(xì)胞癌。手術(shù)病理證實(shí)18例患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，36例患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤按照2008年WHO喉鱗癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：高分化(G1)16例、中分化(G2)19例、低分化(G3)19例，按照2002年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第7版《病理學(xué)》教材，人民衛(wèi)生出版社)，Ⅰ～Ⅱ期為37例，Ⅲ～Ⅳ期為17例。正常的喉粘膜組織(法醫(yī)尸檢)或喉癌旁正常組織42例，作為對(duì)照。

1.2 試劑

鼠抗人Bcl-2、Ki-67蛋白單克隆抗體，免疫組化即用型SP試劑盒，液體DAB酶底物顯色試劑盒，上述試劑均購(gòu)自福建邁新生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

高壓鍋，LEICA RM125輪式切片機(jī)，Olympus BX41顯微鏡，丹吉爾圖像采集系統(tǒng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

SP免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果判定參照Pavlovic B[5]等的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用計(jì)算機(jī)spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，等級(jí)資料采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)，組間比較用χ2檢驗(yàn)，Bcl-2和Ki-67在喉鱗癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性比較采用Spearrnan相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-2和Ki-67蛋白在正常的喉粘膜組織和喉鱗癌組織中的表達(dá)檢測(cè)

Bcl-2和Ki-67蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況(見(jiàn)圖1)：Bcl-2蛋白著色主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜中，在喉鱗狀細(xì)胞癌中陽(yáng)性率為70.37%；而在正常喉粘膜組織中不表達(dá)或在基底層微弱表達(dá)，陽(yáng)性率僅為9.52%(表1)，Bcl-2蛋白在喉鱗癌中的表達(dá)水平明顯高于在正常喉粘膜鱗狀上皮組織中的表達(dá)水平(P<0.05)。而Ki-67蛋白的著色位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕色顆粒，在喉鱗癌組織中陽(yáng)性率為81.48%，在正常喉粘膜組織陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%，亦在喉鱗癌組織中陽(yáng)性率顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 喉鱗癌組織中及正常喉粘膜鱗狀上皮組織中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達(dá)分析

2.2 Bcl-2和Ki-67蛋白的表達(dá)與其臨床病理關(guān)系分析

Bcl-2蛋白的表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性(P<0.05)，但與性別、年齡等無(wú)關(guān)。Ki-67蛋白在喉鱗癌組織TNM分期中陽(yáng)性表達(dá)晚期高于早期、且與分化程度明顯相關(guān)，在分化程度較低的喉鱗癌癌組織中表達(dá)較高；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05，見(jiàn)表2)。

圖1 IHC分析Bcl-2、Ki-67在正常組織和喉癌組織中的表達(dá)(×400)

表2 喉鱗癌組織Bcl-2和Ki-67蛋白表達(dá)與臨床資料的相關(guān)性分析

2.3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白表達(dá)相關(guān)性

44例Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)的喉鱗癌組織標(biāo)本中有34例同時(shí)表達(dá)Bcl-2蛋白。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白與Ki-67表達(dá)呈中度正相關(guān)(rs=0.317，P<0.05)。

表3 Bcl-2蛋白和Ki-67蛋白在LSCC中表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討 論

喉鱗癌是頭頸部最常見(jiàn)的上皮組織來(lái)源的惡性腫瘤之一，該病具有起病隱匿、侵襲力強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差的特點(diǎn)[6]，因此，深入研究其分子機(jī)制具有十分重要意義。

正常細(xì)胞的增殖、分化和凋亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而增殖和凋亡的失衡[7]是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。Bcl-2是屬于一類重要的抗凋亡基因，其表達(dá)失調(diào)將引起細(xì)胞紊亂、參與腫瘤的發(fā)生[8]，同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2高表達(dá)還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，喉鱗癌中的Bcl-2呈現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常組織，且與喉鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.01)，提示Bcl-2蛋白可能參與了喉鱗癌發(fā)生與發(fā)展，這為臨床診斷喉鱗癌提供了參考價(jià)值[10]。Ming Geng等研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2表達(dá)水平高的胃癌患者容易出現(xiàn)廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其預(yù)后較差[11]，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：Bcl-2蛋白在喉鱗癌Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)顯著高于喉鱗癌Ⅰ～Ⅱ期中的表達(dá)(P<0.05)，腫瘤臨床分期愈晚，組織分化惡性程度愈高，Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)也愈高。在甲狀腺癌[12]、肺癌[13]、膽囊癌[14]、前列腺癌[15]和頭頸部鱗癌[9]中Bcl-2蛋白的高表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)，上述報(bào)道與本課題研究也保持一致。同時(shí)，Bcl-2高表達(dá)的惡性腫瘤細(xì)胞也可能因?yàn)樘颖艿蛲龆^(guò)度積累，對(duì)凋亡信號(hào)變得不敏感，則使腫瘤細(xì)胞獲得生存優(yōu)勢(shì)，從而有利于喉鱗癌的發(fā)生及發(fā)展[9]?？傊?，Bcl-2高表達(dá)在喉鱗癌的惡性進(jìn)展、局部浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要的作用，是其預(yù)后不良的一個(gè)標(biāo)志。

Ki-67蛋白是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，是可靠并迅速地反映惡性腫瘤增殖率的指標(biāo)，其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記物[16]，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后有影響[17]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)：Ki-67蛋白在喉鱗癌中的陽(yáng)性率為81.48%，而在正常喉粘膜中的表達(dá)僅為16.67%，兩者比較有顯著的意義(P<0.05)。Ki-67的表達(dá)還與分期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Ki-67蛋白的表達(dá)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移者(P< 0.05)，提示喉鱗癌細(xì)胞增殖活躍與侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良等密切相關(guān)。本研究結(jié)果與Rademakers SE等[18]所報(bào)道的Ki-67蛋白在喉鱗癌中的高表達(dá)增加了侵襲轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)論相一致。

本研究結(jié)果顯示：喉鱗癌中Bcl-2和Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與年齡、性別等無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。與正常組織比較，在喉鱗癌中Bcl-2蛋白與Ki-67蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且兩者呈顯著相關(guān)(rs=0.317,P<0.05)。這與Rahman F等用DigiproTM4.0版圖像分析軟件在口腔鱗狀上皮研究中Bcl-2高表達(dá)，Ki-67蛋白指數(shù)較高，兩者對(duì)比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19]的報(bào)道相符合。也有學(xué)者[20]認(rèn)為，可以把喉鱗癌中Bcl-2和Ki-67蛋白的表達(dá)作為喉鱗癌放射治療預(yù)后判定的指標(biāo)之一，隨表達(dá)的增強(qiáng)喉鱗癌對(duì)放療敏感性相應(yīng)降低，對(duì)于兩者表達(dá)陰性的患者放療效果顯著。但是，有關(guān)研究Bcl-2與Ki-67在喉鱗癌發(fā)展中協(xié)同作用的分子機(jī)制尚未完全闡明，有待深入的研究。

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