應(yīng)用RNAi技術(shù)提高畜禽抗病及生產(chǎn)性狀的研究進(jìn)展

趙春萍，曹 婷，施力光，張立嶺，侯冠彧＊

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州571737；2.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?70228）

RNA 干擾（RNA interterence，RNAi）具有高度保守的特點(diǎn)，普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是由雙鏈RNA引起的特異性沉默靶基因的免疫應(yīng)答反應(yīng)。RNAi技術(shù)能特異性抑制生物體內(nèi)源功能基因的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)表型或生理生化指標(biāo)的變化來(lái)反映該基因的功能。隨著基因組測(cè)序工作的完成，我們也逐漸進(jìn)入了后基因組時(shí)代，基因的功能分析已成為現(xiàn)在的科研重點(diǎn)。自發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象普遍存在線蟲(chóng)、果蠅、小鼠和植物等生物體內(nèi)以來(lái)，RNAi已發(fā)展成為一種簡(jiǎn)便、快速、高效的分析基因組功能的有力工具，也為由基因到功能的反向遺傳學(xué)途徑提供了功能研究的橋梁。

在哺乳動(dòng)物中，研究基因組功能最為常用的方法是通過(guò)同源重組進(jìn)行基因打靶（Gene target）達(dá)到基因敲除（Knock out）的目的，但是這種方法往往會(huì)造成細(xì)胞凋亡，而且也不適用于未建立胚胎干細(xì)胞的動(dòng)物。同時(shí)，基因打靶也存在操作難、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。在線蟲(chóng)、果蠅和植物中，RNAi成功應(yīng)用的長(zhǎng)雙鏈RNA（＞29 bp）又不可避免干擾素效應(yīng)導(dǎo)致的全面關(guān)閉蛋白合成的后果［1］。2001年，Caplen等［2］和Elbashir等［3］發(fā)現(xiàn)短至21～22 nt的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)有效的RNAi，而不誘發(fā)干擾素反應(yīng)。這一研究的發(fā)現(xiàn)全面開(kāi)啟了RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中應(yīng)用的新篇章。本文主要針對(duì)近幾年RNAi在畜禽方面的研究進(jìn)展做出總結(jié)與展望。

1 RNAi機(jī)制

隨著RNAi生化和遺傳學(xué)知識(shí)、數(shù)據(jù)的積累，科學(xué)家們已證實(shí)RNAi是由dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過(guò)程，但其真正的機(jī)理暫時(shí)還不清楚。目前認(rèn)為一般分為以下幾個(gè)步驟：

起始階段：dsRNA進(jìn)入細(xì)胞→由Dicer核酸酶特異性識(shí)別→借助ATP功能的形式切割dsRNA→得到21～23 nt（或bp）的同源小片段siRNA，siRNA與mRNA→識(shí)別目標(biāo)mRNA→啟動(dòng)RNAi反應(yīng)。

效應(yīng)階段：siRNA與核酸酶等蛋白質(zhì)結(jié)合→形成RNA→誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）→依靠ATP提供能量解開(kāi)siRNA雙鏈→激活RISC→活化后的RISC定位到于siRNA中的反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上→在距離siRNA 3′端12個(gè)堿基的位置切割m RNA→降解靶 mRNA［4］。

放大階段：被降解的mRNA片段，在RNA聚合酶的作用下，形成小雙鏈RNA加入到RNAi的起始階段，從而起到了放大的作用。此過(guò)程如圖1所示。

圖1 RNAi作用機(jī)理示意圖Fig.1 RNAi mechanism schematic diagram

RNAi的小非編碼片段主要有三種：piRNAs（PIWI-interacting RNAs）miRNAs（microRNAs），和siRNAs（small interfering RNA）［5］。其中 piRNAs和miRNAs屬內(nèi)源性，由機(jī)體內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄加工形成的非編碼RNA小片段。而siRNAs一直被認(rèn)為是專門(mén)處理外源致病RNA（比如病毒）的片段，但隨著在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)大量?jī)?nèi)源性siRNAs表達(dá)的發(fā)現(xiàn)使這一觀點(diǎn)有所改變［6-7］。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已知有數(shù)以千計(jì)的piRNAs由成簇的重復(fù)序列編碼產(chǎn)生，同時(shí)還有超過(guò)1000種的miRNAs，這些數(shù)據(jù)并不完善，還需要進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)確定。在RNAi的起始階段，RNAi前體要經(jīng)過(guò)一系列酶切過(guò)程才能形成有效的RNA片段，進(jìn)而與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RISC。參與miRNAs加工的酶主要有RNAse III蛋白Drosha和Dicer，siRNAs僅依靠Dicer，而加工piRNAs的核酸酶現(xiàn)在還不確定［8］。miRNA-RISC和siRNA-RISC的主要蛋白是AGO（Argonaute proteins）蛋白，piRNA-RISC的是PIWI蛋白。在沉默復(fù)合體中，RNAi的指導(dǎo)鏈與靶m RNA鏈存在著完全和不完全配對(duì)兩種形式，miRNA為不完全配對(duì)，其他兩種則執(zhí)行完全配對(duì)原則。miRNA的這種配對(duì)方式也導(dǎo)致其具有更廣泛的沉默范圍。

2 RNAi在畜禽傳染性疾病方面的應(yīng)用

畜牧業(yè)是人類(lèi)重要食物、經(jīng)濟(jì)來(lái)源的支柱產(chǎn)業(yè)之一，然而病毒性疾病以其發(fā)病快，影響大等特點(diǎn)嚴(yán)重影響其穩(wěn)步快速的發(fā)展，有些病毒不僅能在畜禽中傳播，甚至可以在人類(lèi)中發(fā)病，嚴(yán)重的能導(dǎo)致死亡。面對(duì)這些病毒，科研人員往往利用抗體來(lái)治療。但是抗體具有高度特異性，只能針對(duì)某種抗原。而病毒在傳播過(guò)程中，通常會(huì)對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，即通過(guò)本身的基因變異來(lái)躲避抗體。病毒的變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抗體的制備速度，而病毒在宿主體增殖過(guò)程中，都要經(jīng)過(guò)m RNA過(guò)程來(lái)翻譯蛋白質(zhì)，這樣便能利用RNAi技術(shù)來(lái)預(yù)防和控制病毒的傳播。

2.1 在豬瘟中的應(yīng)用

豬瘟病以其高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，并被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病之一，同時(shí)我國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。目前，在對(duì)抗豬瘟主要應(yīng)用兔化弱毒疫苗，但其效果越來(lái)越不理想。Li等［9］以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的NS3、Npro、NS5B為靶基因分別設(shè)計(jì)siRNA序列，構(gòu)建使用相同或四個(gè)不同啟動(dòng)子的單、雙和四siRNA表達(dá)質(zhì)粒，與NS3、Npro、NS5B表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)siRNA的抑制效果。結(jié)果表明，單個(gè)或多個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒都可以有效地抑制CSFV復(fù)制，然而針對(duì)不同基因表達(dá)的多個(gè)siRNAs質(zhì)粒載體明顯具有更強(qiáng)的抑制效果。這一研究為更有效的治療豬瘟提供了一定的理論基礎(chǔ)。宋紅芹等［10］針對(duì)非洲豬瘟 病 毒 （African swine fever virus，ASFV）NP419L基因設(shè)計(jì)的5對(duì)shRNA干擾序列也得到了良好的抑制效果，其中兩對(duì)干擾效率達(dá)到87%以上，其他三對(duì)存在顯著性差異（P＜0.05）。為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

目前的研究表明，siRNA作為一種抑制CSFV的有效制劑，雖然不能完全抑制病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制，但也可以降低其增殖速度，為激活自身機(jī)體免疫效應(yīng)爭(zhēng)取時(shí)間，同時(shí)也為新型抗CSFV藥物的研制提供了參考。

2.2 在口蹄疫中的應(yīng)用

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）因?yàn)閭鞑パ杆佟l(fā)病率高的特點(diǎn)嚴(yán)重影響了偶蹄動(dòng)物的養(yǎng)殖，該病廣泛流行于世界各國(guó)，已被OIE列為A類(lèi)家畜傳染病之首，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為第一類(lèi)動(dòng)物疫病的第一病。Ke等［11］以口蹄疫病毒（Footand-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）VP1基因?yàn)榘心繕?biāo)，設(shè)計(jì)并篩選出了5條效率較高的特異性siRNA片段。用這5條siRNA片段分別與報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA只能短暫性抑制FMDV的復(fù)制，48小時(shí)后都出現(xiàn)了CPE現(xiàn)象，提取RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)VP1出現(xiàn)了單核苷酸轉(zhuǎn)換，從而增強(qiáng)了RNAi抗性。Cong等［12］針對(duì)FMDV高度保守的3D，VP4和2B基因序列設(shè)計(jì)siRNA，構(gòu)建siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，與FMVD共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)siRNA有較高的抑制效果，將siRNA表達(dá)質(zhì)粒注入到已感染的乳鼠中，結(jié)果延遲了乳鼠的死亡。隨后以弱毒的S.choleraesuis為siRNA表達(dá)質(zhì)粒的載體，與FMDV分別感染guinea pigs和swine都起到了良好的保護(hù)效果。研究顯示，弱毒的S.choleraesuis因其成本低且對(duì)豬具有安全性的特點(diǎn)從而可以作為RNAi的遞呈系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)。目前沒(méi)有一種疫苗或藥劑可以完全、快速、有效的抑制FMD。所以Kim等［13］結(jié)合抗病毒藥劑和siRNA共同抑制FMD。結(jié)果表明，重組腺病毒siRNA表達(dá)載體與ribavirin混合使用可以明顯增強(qiáng)對(duì)FMDV的抑制效果，其效率高于單獨(dú)使用其中的任意一種。

口蹄疫病毒可分為7個(gè)血清型，且型間沒(méi)有交叉保護(hù)作用，用疫苗治療口蹄疫并不能得到很好的療效。近年來(lái)的研究表明，RNAi技術(shù)作為一種新的基因治療手段，可以有效的抑制病毒，而且當(dāng)與抗病毒藥劑結(jié)合使用時(shí)，可以起到更好的效果。

2.3 在朊病毒中的應(yīng)用

朊病毒是由內(nèi)源性朊蛋白基因（prion protein gene，prnp）編碼的朊蛋白（prion protein，PrP），正常細(xì)胞都會(huì)轉(zhuǎn)錄翻譯該蛋白質(zhì)。該病毒可導(dǎo)致海綿狀腦病，主要包括瘋牛病、一些羊病、鹿病、人的克雅氏癥（Creuzfeldt-Jacob disease，CJD）、吉斯特曼-斯召斯列綜合癥（Gerstmann-Straussler syndrome，GSS）、庫(kù)魯癥（Kuru）等。Mallucci等［14］研究表明敲除PrPc的轉(zhuǎn)基因小鼠可以抵抗朊蛋白病，并且Pr P產(chǎn)量減少一半的動(dòng)物可以抵抗瘋牛病。由于Pr P的功能尚不完全清楚，敲除該基因可能會(huì)有副作用，而RNAi途徑正好可以避免這問(wèn)題的發(fā)生。Li等［15］構(gòu)建了山羊prnp基因和針對(duì)該基因的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，兩者共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后經(jīng)RTPCR檢測(cè)prnp的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒載體可以有效的介導(dǎo)和表達(dá)siRNA，并達(dá)到抑制的效果。而Michael等［16］利用慢病毒介導(dǎo)的sh RNA表達(dá)載體感染山羊成纖維細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，又以此細(xì)胞為核供體細(xì)胞，進(jìn)行體細(xì)胞和移植獲得轉(zhuǎn)基因胎兒，利用RT-PCR和 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胎兒的所有組織的prnp基因表達(dá)都被敲低。隨后以同樣的方法應(yīng)用在?？苿?dòng)物上得到了同樣的效果。該方法可以應(yīng)用到家畜朊病毒的預(yù)防。

目前RNAi技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到畜禽傳染性疾病的各個(gè)方面，其主要方向是針對(duì)某種病的致病病毒的必須蛋白的基因的高度保守序列設(shè)計(jì)sh RNA片段，并構(gòu)建表達(dá)載體，利用慢病毒或腺病毒介導(dǎo)，將sh RNA整合到動(dòng)物基因組中，最后應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得具有抗病基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

2.4 在新城疫病毒中的應(yīng)用

新城疫（Newcastle disease，ND）是造成禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要病癥之一，該病由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引發(fā)，NDV 是單鏈的負(fù)鏈RNA病毒，基因組總長(zhǎng)度大約為15Kb，又稱一型禽副粘病毒（avian paramyxovirus type 1，AMPV-1）。主要編碼六種蛋白質(zhì)：核蛋白（NP），磷蛋白或 V蛋白（P／V），基質(zhì)蛋白（M），融合糖蛋白（F），haemagglutinin neuraminidase glycoprotein（HN），大聚合酶蛋白（L），其順序?yàn)椋?-NP-P-M-FHN-L-5＇。根據(jù)NDV對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)致病性程度可將其分為強(qiáng)毒型、中毒型和弱毒型三種。M蛋白是NDV編碼六個(gè)蛋白中最小的一個(gè)，其主要是構(gòu)成病毒核蛋白的內(nèi)部囊膜。Yin等［17］針對(duì)M基因的641和827位點(diǎn)設(shè)計(jì)了sh RNA，分別命名為pSM641和pSM827，并得到了較好的抑制效果，其中pSM641的抑制效率高達(dá)94.6%，并顯著的降低了CPE的出現(xiàn)。這一結(jié)果表明RNAi針對(duì)M基因不僅可以作為有效的抗病治療方法也可以作為研究DNV復(fù)制的輔助方法。YUE等［18］針對(duì)NP基因設(shè)計(jì)的sh RNA同樣也得到了良好的抑制的效果，其中最高的抑制效率高達(dá)94.14%。

迄今為止，越來(lái)越多的研究表明RNAi作為動(dòng)植物抗病毒藥物制劑具有良好的效果和廣闊的前景，但是其中大部分為體外研究，而體內(nèi)研究很少。讓RNAi完全的發(fā)揮其治療的作用的關(guān)鍵是怎么高效地將RNAi片段遞呈到靶細(xì)胞。遞呈RNA片段的過(guò)程中主要存在兩個(gè)問(wèn)題。首先是生理學(xué)方面的障礙，如siRNA要經(jīng)過(guò)血液到達(dá)靶器官，在經(jīng)過(guò)血管到細(xì)胞間質(zhì)，接著越過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，最后通過(guò)核膜到達(dá)細(xì)胞核中。第二個(gè)就是外源RNA片段本身的穩(wěn)定性問(wèn)題，如在人血液中siRNA和裸露質(zhì)粒的半衰期只有幾分鐘［19-20］。目前主要從生物、化學(xué)和物理三面來(lái)解決這些問(wèn)題。生物學(xué)方法主要是利用病毒載體，如慢病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體。病毒載體在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)都具有高效的沉默效率［21-23］，但是仍存在著具有免疫原性，毒性和引起宿主細(xì)胞基因組插入突變，不能大量表達(dá)病毒載體等缺陷［24-25］?；瘜W(xué)方法主要是陽(yáng)離子復(fù)合物包被RNAi片段，這種方法主要是應(yīng)用與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，而該方法最大的問(wèn)題是具有一定的細(xì)胞毒性［26］。物理方法是直接干擾細(xì)胞質(zhì)膜讓RNAi和質(zhì)粒通過(guò)。目前主要是通過(guò)流體力學(xué)，射擊法，滲透法，超聲波和電場(chǎng)微調(diào)法來(lái)實(shí)現(xiàn)遞呈，這些方法目前還是應(yīng)用與體外研究，也許有希望應(yīng)用與體內(nèi)研究。作為抗病毒藥劑要不僅要有良好的治療效果，而且還要對(duì)機(jī)體沒(méi)有傷害，生物學(xué)方法雖然有較好的效果，但是對(duì)機(jī)體健康還是有一定風(fēng)險(xiǎn)的，物理和化學(xué)方法還不能應(yīng)用與體內(nèi)，由此可見(jiàn)，RNAi作為一種抗病毒藥劑還需要很長(zhǎng)的一段路程。

3 RNAi在改善畜禽生產(chǎn)性狀的應(yīng)用

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)與科技的飛速發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對(duì)畜產(chǎn)品的品質(zhì)要求和需求量愈發(fā)增加。提高豬、牛、羊的產(chǎn)肉性能和畜產(chǎn)品的品質(zhì)現(xiàn)已成為科學(xué)研究者、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者最為關(guān)心的問(wèn)題。

雙肌牛因其特有的飼料報(bào)酬高、瘦肉率高、生長(zhǎng)快的優(yōu)點(diǎn)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，迄今為止，在牛、羊、豬、鼠中均發(fā)現(xiàn)有雙肌性狀的表型，甚至在人中也有這種表型的出現(xiàn)。Mepherron等［27］在小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出一段新的序列，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明該序列是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）超家族中的成員，是肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子。命名為肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN），又稱為生長(zhǎng)分化因子8（GDF-8）。研究表明，該基因的缺失或突變就會(huì)導(dǎo)致肌肉過(guò)度生長(zhǎng)或肥大，即雙肌現(xiàn)象。目前科研人員主要應(yīng)用RNAi技術(shù)，特異性敲低MSTN的表達(dá)，從而得到具有雙肌性狀的動(dòng)物。Jain等［28］設(shè)計(jì)4條sh RNA序列，并構(gòu)建了質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到羊成纖維細(xì)胞系中，篩選出兩條高效抑制MSTN的序列，抑制效率分別為80.5%和92.4%。Ajai等［29］應(yīng)用同樣的方法在雞的胚胎成纖維細(xì)胞中也篩選出了具有高效抑制效率的shRNA序列。說(shuō)明RNAi技術(shù)可以應(yīng)用于動(dòng)物雙肌性狀的產(chǎn)生。Liu等［30］利用RNAi技術(shù)干擾表達(dá)羊MSTN的同時(shí)，伴隨著MyoD和myogenin的上調(diào)，以及Smad3的下調(diào)，該作用機(jī)制與小鼠類(lèi)似。Hu等［31］構(gòu)建sh RNA表達(dá)載體，隨后利用體細(xì)胞核移植技術(shù)得到5只小羊，其中有3只發(fā)現(xiàn)了shRNA的表達(dá)，抑制了MSTN的表達(dá)，其生長(zhǎng)性狀明顯高于其他2只。由此可見(jiàn)，我們可以應(yīng)用RNAi技術(shù)構(gòu)建MSTN干擾表達(dá)的轉(zhuǎn)基因家畜，從而提到高其產(chǎn)肉性能。

作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的奶制品是人們尤其是嬰兒的必須品之一，但由于β乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）作為一種主要的抗敏原的存在（占牛乳清蛋白總量的56%-60%）使部分人群不能利用乳產(chǎn)品。為了去除抗敏原，科研人員采用很多方法（如熱處理、酶解、發(fā)酵、糖基化和 Maillard反應(yīng)等）并沒(méi)起到良好作用［32-34］。Zhang等［35］曾構(gòu)建 BLG 過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到山羊胚胎成纖維細(xì)胞中，同時(shí)用慢病毒介導(dǎo)的shRNA表達(dá)載體感染該細(xì)胞，使shRNA表達(dá)體系穩(wěn)定的整合到山羊基因組中，由此獲得了在胚胎成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。這為干擾表達(dá)BLG的轉(zhuǎn)基因羊的生成提供了理論依據(jù)。

RNAi技術(shù)應(yīng)用于改善畜禽的生產(chǎn)性狀主要是利用siRNA敲低某個(gè)對(duì)生產(chǎn)性狀不利的基因，并將該siRNA的表達(dá)體系整合到宿主基因組中，再通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚，以期得到可以穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。但是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建仍然是生物學(xué)的難點(diǎn)，而且其成本依然很高。這些都嚴(yán)重影響著RNAi技術(shù)在這方面的應(yīng)用。Matoba等［36］利用RNAi敲低了小鼠重構(gòu)胚中Xist基因（負(fù)責(zé)X染色體失活的基因），使重構(gòu)胚的存活率比對(duì)照組高十倍。結(jié)果表明利用體細(xì)胞核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法還是有希望應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的。

4 問(wèn)題與展望

自RNAi現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其一直成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并以其顯著的優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展成一項(xiàng)研究反向遺傳學(xué)強(qiáng)有力的工具。但就目前的研究來(lái)看，RNAi的作用機(jī)制尚不完全清楚，同時(shí)對(duì)基因功能的復(fù)雜性認(rèn)識(shí)仍然很匱乏。即使利用慢病毒介導(dǎo)將siRNA整合的宿主基因組中，并得到穩(wěn)定表達(dá)，但是對(duì)生物的整個(gè)生命過(guò)程是否有影響，我們?nèi)匀徊磺宄?。?yīng)用RNAi技術(shù)還存在一些安全性問(wèn)題，由于siRNA片段可以降解與其同源的RNA，在對(duì)動(dòng)物疾病的治療過(guò)程中，siRNA也有可能將宿主內(nèi)源RNA同時(shí)降解，對(duì)動(dòng)物造成不同程度的損傷甚至死亡。Grimm等［37］將大劑量的sh RNA注入到小鼠體內(nèi)時(shí)，使部分小鼠細(xì)胞內(nèi)的正常RNA功能受到干擾，嚴(yán)重者甚至死亡。這表明我們?cè)趹?yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因治療時(shí)一定要更加謹(jǐn)慎。有研究報(bào)道，RNAi也可以引起自身的防御機(jī)制，如干擾素反應(yīng)，這一防御反應(yīng)也會(huì)造成機(jī)體自身的損害。RNAi技術(shù)在對(duì)疾病治療的應(yīng)用方面取得了不少成果，但這其中還是存在著一些問(wèn)題，用RNAi進(jìn)行疾病治療時(shí)其效果無(wú)法保證，即使應(yīng)用軟件設(shè)計(jì)得分很高的siRNA片段，其抑制效果仍然有可能很低。在對(duì)病毒性疾病治療的過(guò)程中，往往會(huì)出現(xiàn)病毒逃逸的突變體，導(dǎo)致RNAi無(wú)法識(shí)別。因此RNAi的應(yīng)用仍然存在著很多問(wèn)題，如RNAi抑制效果的時(shí)效性，啟動(dòng)子、載體的選擇等都有待解決。

RNAi雖然還存在著諸多問(wèn)題，但還是為人們研究基因功能提供了新的方法和思路。RNAi的出現(xiàn)同時(shí)也給HIV、脊髓灰質(zhì)炎、丙肝和腫瘤等疾病的治療帶來(lái)希望。隨著RNAi分子機(jī)制的進(jìn)一步揭示及其技術(shù)實(shí)現(xiàn)策略的不段改進(jìn)，RNAi將很快應(yīng)用到更多的大型動(dòng)物模型上，而且RNAi的高通量應(yīng)用也將實(shí)現(xiàn)，這勢(shì)必會(huì)更好地造福于人類(lèi)。

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