CCNG2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達及其臨床意義*

陳祥龍 何克菲 陳筱婷

神經(jīng)膠質(zhì)瘤以其高發(fā)病率、高復發(fā)率和高死亡率已成為臨床亟待解決的難題。占神經(jīng)膠質(zhì)瘤一半的膠質(zhì)母細胞瘤患者的平均生存時間僅約14.6個月，5年生存率低于3.3%［1］。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞快速且浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，多數(shù)發(fā)生不限于一個腦葉，手術無法徹底清除腫瘤病灶［2］。不同部位病理特征不同，其惡性程度也不同，單純手術和放化療不能阻止腫瘤復發(fā)和向周圍腦組織發(fā)生侵襲性轉移，復發(fā)率高達100%［3-4］，其發(fā)生、發(fā)展機制目前尚未完全闡明。因此闡明影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的分子機制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療尋找新的靶點，已成為當今神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床治療學的熱點課題之一。

細胞周期蛋白G2（cell cyclin，G2）由CCNG2基因編碼，與cyclin G1同屬于細胞周期蛋白G家族［5］。CCNG2基因定位于染色體5p3.3，編碼基因含有8個外顯子，其cDNA長度約8.60 kb，相對分子量為40×103。人類CCNG2與CCNG1顯示了較低的同源性，僅有60%的核苷酸序列及53%的氨基酸序列一致；而與cyclin A的氨基酸序列則只有26%的一致性［6］。目前的研究發(fā)現(xiàn)CCNG2可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展和化療耐藥過程［7］。為了驗證神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2的表達情況及其與臨床預后的關系，本研究應用QRT-PCR及免疫組織化學的方法對臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年1月至2012年8月在本院行手術切除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本149例，選擇資料完整的神經(jīng)膠質(zhì)瘤病例109例進行研究，手術標本部分經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，進行免疫組織化學染色。部分手術標本放入液氮冷凍后，用錫紙包裹，在研缽中充分研磨，研磨后用Trizol反復洗滌研磨的碎末，用經(jīng)DEPC水處理后的凍存管收集，放入液氮，用時提取RNA進行檢測。所有病例術前均未行放化療。本研究經(jīng)珠江醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：全部109例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和復查隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2013年5月31日，至隨訪截止日，依然生存46例，死亡63例，無失訪病例。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及實時熒光定量PCR 按照試劑說明書，通過Trizol提取試劑盒從神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中提取總RNA，操作按照說明書進行。測量總RNA濃度，取1 μg RNA按逆轉錄合成試劑盒說明合成cDNA，然后以該cDNA為模板，PCR儀中擴增從神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中提取的總RNA進行逆轉錄和實時熒光定量PCR。CCNG2及內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表1。逆轉錄反應及PCR擴增參照試劑盒說明進行，以CCNG2基因的上下游引物進行PCR擴增，PCR反應在實時定量PCR反應儀上進行。重復實驗3次。數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析?！鳌鰿t=（待測樣品的目的基因的Ct的平均值-待測樣本的管家基因的Ct的平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct的平均值-對照樣本的管家基因的Ct的平均值）。

表1 CCNG2及內(nèi)參照GAPDH的引物序列Table1 Primer sequence of CCNG2 and GAPDH

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片、脫蠟、水化，PBS沖洗3×3 min，高溫高壓抗原修復。加3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗3×3 min，加第一抗體，一抗CCNG2為鼠抗人單克隆抗體。室溫下孵育60 min，PBS沖洗3×5 min。加聚合物增強劑（試劑A），室溫孵育20 min，PBS沖洗3×3 min。加酶標抗鼠聚合物（試劑B），室溫下孵育30 min，PBS沖洗3×3 min。加新配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色。自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗返藍。梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片，所有標記均設陽性對照并用PBS緩沖液代替一抗行陰性對照。免疫組織化學的檢測結果進行半定量判定。切片由兩位病理學醫(yī)師重復觀察，結果有分歧時由第三人觀片，討論判定。隨機選取5個高倍視野，按照細胞染色強度進行評分。如果陽性細胞數(shù)＜10%為+，10%～29%為++，30%～49%為+++，≥50%為++++。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。CCNG2在各級神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達差異采用單因素方差分析的方法，CCNG2的表達與各臨床病理參數(shù)之間的關系使用Chi-Square檢驗，采用Kaplan-Meier法分析CCNG2的表達與生存期的關系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCNG2基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達

QRT-PCR法檢測CCNG2在非腫瘤組織（包括癌旁組織和正常腦組織）及神經(jīng)膠質(zhì)瘤各級組織標本中的表達，結果提示CCNG2基因的表達水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而降低，并且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級別呈負相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 QRT-PCR檢測CCNG2基因在正常非腫瘤組織及各級神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中的表達（*P＜0.05）Figure1 CCNG2 expression was examined in non-tumor tissues and in tissues from different stages of glioblastoma via QRT-PCR,*P＜0.05

2.2 CCNG2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達

免疫組織化學方法檢測CCNG2在各級神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本中的表達，結果提示CCNG2陽性細胞分布在細胞質(zhì)和細胞膜著色（圖2）。CCNG2表達水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而降低，并且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理級別呈負相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 CCNG2的表達及其與臨床參數(shù)的關系

患者中男性94例，女性15例。患者年齡36～86歲，中位年齡60歲，60歲以下患者54例，60歲以上患者55例。神經(jīng)膠質(zhì)瘤Ⅰ級患者19例，Ⅱ級29例，Ⅲ級26例，Ⅳ級35例。化療敏感者（化療后3個月未見腫瘤復發(fā)或疾病處于穩(wěn)定狀態(tài)）73例，化療抗拒者（化療后3個月內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)和轉移）36例。放療敏感者（放療后3個月未見腫瘤復發(fā)或疾病處于穩(wěn)定狀態(tài)）44例，放療抗拒者（放療后3個月內(nèi)出現(xiàn)復發(fā)和轉移）65例。截止研究工作完成，生存病例46例，死亡病例63例。CCNG2蛋白的表達與患者性別、年齡無關（均P＞0.05）；而與腫瘤的分級、對放化療的敏感性及總生存時間相關（均P＜0.05，表2）。

圖2 CCNG2在各級神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達（SP×200）Figure2 CCNG2 expression was demonstrated in glioblastoma tissues

表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CCNG2的表達與臨床參數(shù)的關系Table2 Association of CCNG2 in clinical tissue samples with the clinical parameters of glioblastoma

2.4 CCNG2及臨床各參數(shù)對患者生存時間的影響

采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，結果發(fā)現(xiàn)CCNG2的表達、患者對放化療的敏感性及腫瘤的分級與患者的生存時間密切相關，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），其中高表達CCNG2患者的生存時間較低表達者明顯增加。腫瘤的病理分級越高，患者的生存時間越短，放化療敏感者的生存時間較抗拒者的生存時間長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 Kaplan-Meier檢驗各臨床參數(shù)對患者生存時間的影響Figure3 Influence of clinical parameters on glioblastoma survival

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的45%～50%，也是顱內(nèi)腫瘤患者的主要死亡病因之一［8-10］。神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分為Ⅰ～Ⅳ級。除Ⅰ級以外，幾乎所有低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤最終均進展到高級別惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，即Ⅳ級膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）［11］。后者是最常見、惡性程度最高的神經(jīng)膠質(zhì)瘤。GBM患者的治療方法是外科手術結合放療、化療，其中化療以烷基化藥物替莫唑胺（temozolomide，TMZ）為主，聯(lián)合或未聯(lián)合應用亞硝基脲類。盡管這些治療方案有了長足的發(fā)展，但膠質(zhì)母細胞瘤患者最終預后極差，目前中位生存期仍未超過14個月［12-13］。因此深入研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及化療耐藥產(chǎn)生的分子機制對于膠質(zhì)母細胞瘤的診斷與治療具有十分重要的意義。

目前研究CCNG2功能的文獻較少，主要集中在1）CCNG2是細胞周期負性調(diào)節(jié)因子，能夠抑制細胞周期的進程［6，14-16］；2）CCNG2是潛在的抑癌基因，其表達的缺失可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程［17-19］。然而關于CCNG2在細胞周期中的表達調(diào)控機制尚未完全清楚。目前有研究報道CCNG2可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展和化療耐藥過程［7，20］。為了驗證神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2的表達情況，本研究應用QRT-PCR及免疫組織化學的方法在收集到的臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本上進行檢測。結果表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中存在CCNG2 mRNA下調(diào)現(xiàn)象，其中高級別（WHOⅢ～Ⅳ級）神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中CCNG2 mRNA轉錄水平明顯下調(diào)，與低級別（WHOⅠ～Ⅱ級）神經(jīng)膠質(zhì)瘤相比差別顯著（P＜0.05）。本研究對109例免疫組織化學標本的分析表明，低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的細胞質(zhì)中可見CCNG2蛋白染色，隨著腫瘤級別的增高，CCNG2蛋白陽性率呈下降趨勢。高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織陽性率明顯低于低級別組（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲線提示CCNG2蛋白高表達患者預后好于低表達者，CCNG2的表達與患者性別、年齡無關（均P＞0.05），而與腫瘤的分級、對放化療的敏感性及總生存時間相關。本研究將有助于闡明神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及放化療抗拒的分子機制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療尋找新的靶點。

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