二氫青蒿素對胃癌細胞血管生成及相關(guān)基因表達的影響

王愛軍 施 華 鄭寶軍 馮俊偉 王紅鈺 吳 肖

胃癌是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，且易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞增殖和遠處轉(zhuǎn)移均依賴于血管生成提供營養(yǎng)，而腫瘤細胞分泌的多種血管生成因子如VEGF-C、COX-2等在血管新生過程中發(fā)揮極其重要的作用。二氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，具有較強的抗腫瘤作用。有報道稱，青蒿素通過抑制VEGF從而抑制腫瘤淋巴管生成［1］，DHA能抑制胰腺癌細胞中血管生成［2］。本研究利用人胃癌細胞株SGC7901，觀察DHA對SGC7901細胞血管生成及相關(guān)基因表達的影響及意義，為DHA的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑與儀器 RPMI 1640、胰蛋白酶、胎牛血清均為美國 Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、二甲亞砜、3-（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基氮唑溴鹽（MTT）購自美國Sigma公司；二氫青蒿素（批號：100184-200402）購于中國生物藥品檢定所；VEGF-C、COX-2、VCAM-1、PTEN和GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司；TRIzol試劑為美國invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；Real-Time PCR試劑盒購自加拿大Fermentas公司；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。Real-Time PCR儀購自美國ABI公司；電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞株培養(yǎng)和實驗分組 胃癌細胞SGC7901購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。SGC7901細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，80%匯合后胰蛋白酶消化法傳代培養(yǎng)，于傳代后第2天換液。

1.2.2 MTT分析 96孔板接種5×104/孔SGC7901細胞，培養(yǎng)24 h 后，5、10、20、40、80 μmol/L DHA處理細胞24、48、72 h。以含0.1%DMSO的培養(yǎng)基為陰性對照組。取其中1個96孔板加入20 μL/孔新鮮配制的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去培養(yǎng)液，加入 150 μL/孔 DMSO，室溫振蕩 10 min，于酶標儀490 nm波長測OD值。另取96孔板分別加入5、10、20、40、80 μmol/L的DHA，每組6個復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，結(jié)束前4 h加入20 μL/孔新鮮配制的MTT，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL），37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO，室溫振蕩10 min，于酶標儀490 nm波長檢測代表細胞的增殖活性（OD值）。

1.2.3 總RNA提取及熒光定量RT-PCR 80%匯合后的SGC7901細胞經(jīng)胰蛋白酶消化法傳代，培養(yǎng)24 h后，5、10、20、40、80 μmol/L DHA刺激細胞 24 h，或50 μmol/L DHA 刺激細胞 24、48、72 h，以含 0.1%DMSO的培養(yǎng)基為陰性對照組。各組細胞總RNA采用TRIzol試劑按照說明書進行提取，經(jīng)核酸定量分析儀測定濃度和純度后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性后用于反轉(zhuǎn)錄和熒光定量RT-PCR實驗。取2 μg總的RNA在 25 μL體系中逆轉(zhuǎn)成cDNA，根據(jù)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。熒光定量RT-PCR反應(yīng)如下：95℃4 min，進行35個循環(huán)。條件為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；最后72℃ 5 min。使用的序列（表1）。所有反應(yīng)均設(shè)3個平行組，實驗結(jié)束后，每對引物的擴增產(chǎn)物均進行溶解曲線分析及相對表達量的計算。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測 80%匯合后的SGC7901細胞經(jīng)胰蛋白酶消化法傳代，培養(yǎng)24 h后，5、10、20、40、80 μmol/L DHA處理細胞24 h，或50 μmol/L DHA處理細胞24、48和72 h，以含0.1%DMSO的培養(yǎng)基為陰性對照組。收集細胞，并將細胞用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，用含RIPA的裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每泳道40 μg上樣，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后加入特異性一抗（稀釋比例為1:500～1:1 000），4℃過夜。洗膜后加入1:5 000的HRP標記的相應(yīng)二抗37℃孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光劑顯色、曝光、顯影、定影。實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DHA對細胞活力的影響

通過MTT實驗測定DHA對細胞的活力的影響，結(jié)果顯示，與含0.1%DMSO對照組比較，各濃度DHA對細胞活力均有明顯的抑制作用，細胞活力隨著DHA濃度的增加及作用時間延長而降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由此表明，DHA顯著抑制細胞生長，且抑制效應(yīng)呈劑量和時間依賴性（圖1）。

2.2 DHA對胃癌細胞血管生成相關(guān)因子mRNA表達的影響

熒光定量RT-PCR的結(jié)果顯示，與含0.1%DMSO對照組比較，40 μ mol/L DHA作用細胞48 h，VEGF-C、COX-2和VCAM-1 mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0.05），PTEN mRNA表達明顯升高（P＜0.05），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.3 DHA對胃癌細胞血管生成相關(guān)因子蛋白表達的影響

Western blot分析的結(jié)果顯示，與含0.1%DMSO對照組比較，40 μmol/L DHA作用細胞48 h，VEGF-C、COX-2和VCAM-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05），PTEN蛋白表達明顯升高（P＜0.05），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖1 DHA對細胞的活力的影響Figure1 Effect of DHA on cell viability

圖2 DHA對胃癌細胞血管生成相關(guān)因子mRNA表達的影響Figure2 DHA expression and blood vessel correlative factor mRNA in gastric cancer cells

圖3 DHA對胃癌細胞血管生成相關(guān)因子蛋白表達的影響Figure3 DHA expression and blood vessel correlative factor protein in gastric cancer cells

3 討論

腫瘤所在的微環(huán)境是除了腫瘤自身因素外決定腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，尤其腫瘤周圍微血管的生成是腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，與預(yù)后密切相關(guān)，而腫瘤血管的生成又會受到血管生成促進因子和血管生成抑制因子雙方面的調(diào)節(jié)。血管生成促進因子增多和（或）血管生成抑制因子減少，均可導(dǎo)致血管生成過程的啟動。

由于中藥作用于腫瘤具有多靶點調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，且目前許多化療藥物在治療過程中不良反應(yīng)大，治療效果不理想，因此，在植物中尋找低毒高效的抗腫瘤藥物已成為目前國內(nèi)外重要的研究課題。二氫青蒿素是青蒿素類藥物在體內(nèi)主要活性代謝產(chǎn)物，且呈現(xiàn)出比其他青蒿素類藥物更強的抗腫瘤活性。近年來發(fā)現(xiàn)，DHA能抑制如胰腺癌［3］、前列腺癌［4］和肺癌［5］等多種腫瘤細胞生長，具有較好的應(yīng)用前景。

本實驗中使用6.25～100 μmol/L的DHA作用細胞，以劑量和時間依賴的方式抑制細胞增殖。在此基礎(chǔ)上，進一步從分子角度探討了DHA對腫瘤血管生成因子表達的影響，結(jié)果顯示DHA能以劑量和時間依賴性抑制SGC7901細胞中VEGF-C、COX-2和VCAM-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時對PTEN的轉(zhuǎn)錄和翻譯則有明顯的促進作用。VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子，能夠特異地促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及腫瘤血管生成［6］。多種腫瘤組織中VEGF表達上調(diào)，且其表達上調(diào)與血管生成密切相關(guān)。國內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)，中藥能抑制VEGF的表達，如雷公藤內(nèi)酯醇、胃安寧顆粒及健脾解毒方都能通過抑制胃癌細胞或胃癌組織中VEGF表達發(fā)揮抗腫瘤作用［7-9］，本研究發(fā)現(xiàn)DHA也具有較強的抑制胃癌細胞VEGF表達的作用，因此推測DHA也可能通過抑制VEGF表達從而抑制胃癌組織血管生成，后續(xù)體內(nèi)實驗將進一步明確這一結(jié)果。

環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素（PGs）合成過程中的一個重要限速酶，已經(jīng)明確，COX-2具有明顯的促進腫瘤血管生成的作用［10-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，COX-2和VCAM-1在胃癌組織中表達較高，與VEGF變化一致，且同時伴MVD升高［14］；PTEN在胃癌組織中表達較低，與VEGF變化相反［15］。本研究結(jié)果顯示，DHA也能抑制胃癌細胞COX-2和VCAM-1的表達，促進PTEN表達。

綜上所述，中藥DHA能通過影響不同類型腫瘤血管生成相關(guān)基因的表達，以多靶點、多角度的方式抑制胃癌細胞的生長。本研究為臨床上以中藥治療或者輔助治療胃癌提供了有力的證據(jù)，但由于基礎(chǔ)研究與體內(nèi)藥物作用有所差異，相關(guān)體內(nèi)研究機制探討將在后續(xù)實驗中得到印證。

1 Wang J,Zhang B,Guo Y,et al.Artemisinin inhibits tumor lymphangiogenesis by suppression of vascular endothelial growth factor C[J].Pharmacology,2008,82(2):148-155.

2 Wang SJ,Sun B,Cheng ZX,et al.Dihydroartemisinin inhibits angiogenesis in pancreatic cancer by targeting the NF-κB pathway[J].Can Chem Phar,2011,68(6):1421-1430.

3 Aung W,Sogawa C,Furukawa T,et al.Anticancer effect of dihydroartemisinin(DHA)in a pancreatic tumor model evaluated by conventional methods and optical imaging[J].Anti Res,2011,31(5):1549-1558.

4 Morrissey C,Gallis B,Solazzi JW,et al.Effect of artemisinin derivatives on apoptosis and cell cycle in prostate cancer cells[J].Anti Drugs,2010,21(4):423-432.

5 Zhou HJ,Zhang JL,Li A,et al.Dihydroartemisinin improves the efficiency of chemotherapeutics in lung carcinomas in vivo and inhibits murine Lewis lung carcinoma cell line growth in vitro[J].Canc Chem Phar,2010,66(1):21-29.

6 Chen P,Zhu J,Liu DY,et al.Over-expression of survivin and VEGF in small-cell lung cancer may predict the poorer prognosis[J].Med Oncol,2014,31(1):775.

7 Wang GP,Yin CJ,Ouyang S,et al.And the effects of triptolide on the expression of vascular endothelial growth factor on proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901[J].J of Prac Medi,2008,24(1):17-19.[王國平,尹成進,歐陽曙,等.雷公藤內(nèi)酯醇對人胃癌細胞SGC-7901增殖及表達血管內(nèi)皮生長因子的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2008,24(1):17-19.]

8 Xu YQ,Shen MQ,Wu H,et al.Experimental study of weianning granules inhibit tumor angiogenesis[J].Jiangsu J of Trad Chin Medi,2010,42(4):76-77.[許尤琪,沈明勤,吳 昊,等.胃安寧顆粒抑制腫瘤血管生成的實驗研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2010,42(4):76-77.]

9 Liu NN,Wang Y,Zhou LH,et al.Inhibition of jianpi jiedu recipe on angiogenesis in helicobacter plori-induced gastric cancer[J].Chin J of Exp Trad Medi Form,2011,17(1):88-95.[劉寧寧,王 炎,周利紅,等.健脾解毒方對幽門螺桿菌誘發(fā)胃癌血管新生的抑制研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(1):88-95.]

10 Cheng J,Fan XM.Role of cyclooxygenase-2 in gastric cancer development and progression[J].World J Gastroenterol,2013,19(42):7361-7368.

11 Kargi A,Uysal M,Bozcuk H,et al.The importance of COX-2 expression as prognostic factor in early breast cancer[J].J Buon,2013,18(3):579-584.

12 Ma JX,Sun YL,Wang YQ,et al.Triptolide induces apoptosis and inhibits the growth and angiogenesis of human pancreatic cancer cells by downregulating COX-2 and VEGF[J].Oncol Res,2013,20(8):359-368.

13 Li W,Tang YX,Wan L,et al.Effects of combining Taxol and cyclooxygenase inhibitors on the angiogenesis and apoptosis in human ovarian cancer xenografts[J].Oncol Lett,2013,5(3):923-928.

14 Tang H,Wang J,Bai F,et al.Positive correlation of osteopontin,cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth actor in gastric cancer[J].Can Inv,2008,26:60-67.

15 Huang J,Kontos CD.PTEN modulates vascular endothelial growth factor-mediated signaling and angiogenic effects[J].J Biol Chem,2002,277(13):10760-10766.