高遷移率族蛋白1和腫瘤相關(guān)巨噬細胞與宮頸癌淋巴管密度的相關(guān)性研究

李妍郝權(quán)

宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，晚期宮頸鱗癌治療效果極差。淋巴轉(zhuǎn)移是宮頸鱗癌的重要轉(zhuǎn)移途徑，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。近年來研究表明高遷移率族蛋白1（HMGB1）在多種實體瘤中過度表達，對腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤，特別是對腫瘤的淋巴管形成有重要的影響［1］。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-asscociated macrophages，TAMs）不僅有吞噬和抗原提呈等作用，而且能通過自分泌或旁分泌多種細胞因子，誘導(dǎo)腫瘤周圍微血管和淋巴管的新生，致使腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。但在宮頸鱗癌方面，本研究通過復(fù)習(xí)宮頸鱗癌患者臨床病理資料，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測HMGB1、CD68及D2-40在CSCC中的表達水平，探討HMGB1表達、TAMs計數(shù)與LVD的相關(guān)性及其對預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2007年1月至2008年12月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受宮頸癌根治術(shù)、經(jīng)病理學(xué)證實的原發(fā)性CSCC患者石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本共93例。所有患者術(shù)前無化療、放療或其他治療史。患者年齡25～68歲，中位年齡44歲。其中年齡≥44歲為51例，＜44歲為42例；宮頸鱗癌病理分級：高-中分化、低分化分別為65、28例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，未發(fā)生轉(zhuǎn)移者73例。腫瘤直徑＞4 cm者14例，≤4 cm者79例。浸潤深度：淺肌層（≤1/2）45例，深肌層（＞1/2）48例；FIGO分期：ⅠA期5例，ⅠB期33例，ⅡA期26例，ⅡB期29例。另外收集正常宮頸鱗狀上皮組織標(biāo)本（因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)）作為對照研究。所有患者的臨床資料完整，病理資料由病理科專業(yè)主任醫(yī)師復(fù)習(xí)。所有患者知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 兔抗人HMGB1單克隆抗體、鼠抗人CD68單克隆抗體及鼠抗人D2-40單克隆抗體均購自美國abcam生物公司。免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自基因科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)SP法免疫組織化學(xué)染色。滴加一抗（HMGB1為1:500，CD68為1:300，D2-40為1:40），實驗步驟嚴格按照SP二步法試劑盒說明書進行。已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定：臨床和病理雙盲閱片。1）HMGB1：主要于細胞核表達，陽性染色呈黃色或棕黃色。綜合染色強度和陽性細胞百分率計算染色積分。染色強度：不著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細胞百分率：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；76%～100%，4分。兩項相加分值即為每個視野的染色積分（0～7分），染色積分0分（-）、1～3分（+）、4～5分（++）和6～7分（+++），高倍鏡下隨機取5個不同視野求平均染色積分。染色積分＞3分為高表達（+），≤3分為低表達（-）。2）對CD68標(biāo)記TAMs計數(shù)：CD68主要于巨噬細胞的細胞質(zhì)表達，細胞質(zhì)含清晰的黃褐色或棕黃色顆粒狀者為陽性細胞。計數(shù)結(jié)果判斷方法：在低倍鏡（×100）視野中選取巨噬細胞最密集區(qū)域，在高倍鏡（×400）下隨機計數(shù)5個視野的巨噬細胞，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，大于均值為高表達，小于均值為低表達。3）對D2-40標(biāo)記的淋巴管進行計數(shù)：先在低倍視野內(nèi)（×100）找到腫瘤組織內(nèi)微淋巴管密度最高的區(qū)域即“熱點”，選取3處“熱點”然后在高倍視野內(nèi)（×200）計數(shù)微淋巴管的數(shù)目。分辨不清或染色模糊的細胞不計入計數(shù)結(jié)果。2名病理科主治以上醫(yī)師采用雙盲法分別對同一切片計數(shù)，取兩者計數(shù)中較高的數(shù)據(jù)作為該切片的LVD。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，大于均值為高表達，小于均值為低表達。

1.2.3 隨訪 隨訪時間從術(shù)后開始，隨訪期限到2013年4月31日，隨訪方法為電話隨訪。隨訪93例無失訪。隨訪期間患者死亡是指因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移引起的死亡，其他疾病、意外死亡不計入內(nèi)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。連續(xù)變量采用t檢驗，分類變量采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法及Cox回歸進行生存分析；采用Spearman等級相關(guān)分析進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1、CD68和D2-40在宮頸癌組織及正常宮頸組織中的表達

HMGB1主要表達于宮頸鱗癌細胞胞核，細胞質(zhì)中少有表達，陽性染色呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。HMGB1在正常宮頸鱗狀上皮組織中幾乎無陽性染色，或呈微弱著色，其陽性表達率為12.5%（5/40），在宮頸鱗癌組中的陽性表達率為61.3%（57/93），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD68陽性蛋白表達于TAMs的胞漿中，呈清晰的棕黃色顆粒狀。在宮頸鱗癌組織和正常宮頸鱗狀上皮組織中的陽性表達率分別為51.6%（48/93）和 7.5%（3/40），有顯著性差異（P＜0.05）。D2-40陽性定位于淋巴管內(nèi)皮細胞胞膜和（或）細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。40例正常宮頸鱗狀上皮陽性表達率為10.0%（4/40），明顯低于宮頸鱗癌組織的陽性表達率55.9%（52/93，P＜0.05，圖1～3）。

2.2 HMGB1、TAMs與LVD的相關(guān)性

HMGB1及TAMs表達增高，LVD增高；HMGB1及TAMs表達降低，LVD降低（表1）。

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，HMGB1的表達、TAMs計數(shù)和LVD之間均呈正相關(guān)（r=0.291，P＜0.05；r=0.450，P＜0.01；r=0.787，P＜0.01）。

2.3 HMGB1、TAMs和LVD與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系

HMGB1高表達者中，LVD高表達組的生存時間（54.45±11.275）個月，顯著低于LVD低表達組的生存時間為（61.00±5.904）個月，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.138，P=0.037）。TAMs高表達者中，LVD高表達組的生存時間為（53.44±13.721）個月，顯著低于LVD低表達組的生存時間為（61.57±7.659）個月，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.432，P=0.019，表2）。

單因素分析表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的3、5年生存率分別為75.0%、36.4%，顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（98.6%、87.8%）（χ2=32.925，P＜0.01）。HMGB1高表達組患者的3、5年生存率（89.5%、61.4%）顯著低于低表達組患者（100.0%、96.8%），兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.366，P=0.001）。以TAMs計數(shù)的均值（均值為47.656）為截點分為兩組，高表達組患者的3、5年生存率（89.6%、60.3%）顯著低于低表達組患者（97.8%、94.0%），兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.448，P=0.001）。以LVD的均值（均值為10.623）為截點分為兩組，高表達組患者的3、5年生存率（92.3%、61.3%）顯著低于低表達組患者（95.1%、95.1%），兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.251，P=0.001，表3）。

Cox回歸多因素分析表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與HMGB1表達為獨立的預(yù)后影響因素（P=0.001，P=0.043），而TAMs及LVD不是影響預(yù)后的獨立因素。

圖1 HMGB1在宮頸正常鱗狀上皮組織和宮頸鱗癌組織中表達（SP×400）Figure1 The expression of HMGB1 in the normal cervical squamous epithelium and in CSCC（SP×400）

圖2 CD68在宮頸鱗癌組織中的表達（SP×400）Figure2 The expression of CD68 in CSCC（SP×400）

圖3 D2-40在宮頸鱗癌組織中的表達（SP×200）Figure3 The expression of D2-40 in CSCC（SP×200）

表1 HMGB1、TAMs與LVD的表達相關(guān)性Table1 Correlation of HMGB1，TAM，and LVD expressions

表2 宮頸鱗癌患者的生存分析Table2 Survival analysis of patients with CSCC

表3 宮頸鱗癌患者生存時間的單因素分析Table3 Univariate analysis of the survival time of patients with CSCC

3 討論

宮頸癌是一種轉(zhuǎn)移能力較強的腫瘤，早期即可出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移，在宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，淋巴管系統(tǒng)充當(dāng)著重要角色。

HMGB1是一種廣泛存在的小分子量DNA結(jié)合蛋白，參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)以及細胞運動等。HMGB1過表達于多種腫瘤組織并且與腫瘤細胞的增殖、運動、侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，對腫瘤新生血管、淋巴管的生成有重要的影響。另一方面，HMGB1主要來自損傷或壞死細胞，及含缺氧、內(nèi)毒素、TNF-ɑ等活化的巨噬細胞，而且通過活化的巨噬細胞分泌HMGB1可再度激活巨噬細胞，使其分泌多種細胞因子。隨著研究的不斷進展，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)TAMs存在乳腺癌［2］、卵巢癌、甲狀腺癌［3］等多種腫瘤中，TAMs并非發(fā)揮抗腫瘤作用，而是參與了腫瘤微血管、淋巴管生成及免疫機制等多種機制，促進腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，促進腫瘤的進展［4］。D2-40是一種新的淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物，在血管內(nèi)皮無表達［5］，其免疫組織化學(xué)染色較傳統(tǒng)HE染色判定淋巴管更準確更敏感。

本研究中HMGB1在宮頸鱗癌組織中呈高表達，HMGB1在宮頸鱗癌Ⅱ期組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率明顯高于Ⅰ期組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），而且HMGB1的表達與LVD呈正相關(guān)（r=0.450，P＜0.01），提示HMGB1在宮頸鱗癌的侵襲、淋巴轉(zhuǎn)移及促進腫瘤淋巴管生成過程中起重要作用。這與最近研究表明HMGB1在卵巢癌［6］、膀胱癌［7］、頭頸部癌［8］、肝癌［9］等多種人類惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［10］，且HMGB1蛋白表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11-12］的結(jié)果一致。有淋巴轉(zhuǎn)移組TAMs計數(shù)（53.70±5.57）較無淋巴轉(zhuǎn)移組的（46.00±7.81）明顯增多（P＜0.01），TAMs計數(shù)與LVD呈正相關(guān)（r=0.787，P＜0.01），說明腫瘤相關(guān)巨噬細胞參與宮頸鱗癌的侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且與腫瘤淋巴管生成密切相關(guān)并在多種腫瘤中得到了證實，也與Schoppmann等［13］研究結(jié)果一致。D2-40標(biāo)記的LVD在宮頸鱗癌組織中表達升高，與患者年齡、腫瘤直徑無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的LVD值較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯增高，說明隨著LVD表達量增加，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增多，宮頸鱗癌進展。LVD在許多腫瘤組織中表達升高［14］，高密度的淋巴管可能促使腫瘤細胞與擴增的淋巴管接觸并侵入淋巴管導(dǎo)致淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，加速疾病病程的進展。與Deng等［15］發(fā)現(xiàn)LVD與濾泡狀甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究結(jié)果相一致。本研究表明，HMGB1及TAMs表達增高可以促進淋巴管生成，進而使淋巴管密度增高，從而促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低患者的生存時間。HMGB1蛋白、TAMs及LVD的高表達組患者3、5年生存率均顯著低于其低表達組，這表明HMGB1的表達、TAMs計數(shù)在宮頸鱗癌中扮演著重要角色，對宮頸鱗癌細胞的生長侵襲、淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者的預(yù)后都有著重要的影響。HMGB1表達增高、TAMs計數(shù)升高的患者，LVD表達增強、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增多，患者預(yù)后不良。因此，HMGB1、TAMs及LVD均為影響患者預(yù)后的重要因素。

綜上所述，HMGB1、TAMs在宮頸鱗癌組織中高表達，并通過促進新生淋巴管生成，從而促進其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和影響患者的預(yù)后。HMGB1和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸鱗癌患者的獨立預(yù)后因素，為臨床判斷患者的預(yù)后提供了重要證據(jù)，使得后續(xù)深入探討宮頸鱗癌的治療具有重大意義。而TAMs及LVD作為影響患者預(yù)后的重要因素，有待進一步深入研究以對改善患者預(yù)后提供理論指導(dǎo)。

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