CdTe量子點與蛋白質(zhì)相互作用的熒光猝滅效應

焦 勇，李榮霞，安文汀，李世琴，趙俊紅

（1．山西大學 分子科學研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原030006；2．山西大學 化學化工學院，山西 太原030006）

自1998年水溶性量子點 （Quantum dots，QDs）成功應用于細胞成像以來［1，2］，量子點以其寬激發(fā)－窄發(fā)射光譜和抗光漂白等優(yōu)異性質(zhì)，在生物成像、化學－生物傳感器等領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景［3－9］。CdTe量子點的發(fā)射光譜隨粒徑的改變幾乎可覆蓋整個可見區(qū)，并具有較大的激子Bohr半徑 （7．3nm），正在發(fā)展成為一類新型熒光探針［5］。體外研究量子點與蛋白質(zhì)的相互作用及其對各自結構與性質(zhì)的影響，可以模擬體內(nèi)量子點與蛋白質(zhì)的相互作用，為設計拓展量子點的生物醫(yī)學應用提供依據(jù)。盡管人們已得到了量子點與蛋白質(zhì)相互作用的結合常數(shù)［10］、熱力學參數(shù)和驅(qū)動力等信息［11－14］，但量子點與蛋白質(zhì)作用對雙方熒光性質(zhì)的影響等關鍵問題，迄今尚未完全明了。

細胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）是一種含鐵卟啉蛋白，非常適宜于傳遞電子，是高效的熒光猝滅劑［14－18］。Cyt c表面的正電性殘基使其可通過靜電作用與表面負電性量子點發(fā)生相互作用。牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）有兩個色氨酸殘基（Trp212和134）［19－22］，具有內(nèi)稟熒光；其表面的殘基側鏈能與量子點通過多種非共價作用相結合。

本文利用水熱法合成了以N－乙?；腚装彼幔∟－acetylcysteine，NAC）為穩(wěn)定劑的水溶性CdTe和CdTe／CdS核殼量子點，研究了生理條件下Cyt c對不同粒徑的CdTe和CdTe／CdS核殼量子點的熒光猝滅效應，以及CdTe量子點對BSA的熒光猝滅效應，并闡述了猝滅機理，為基于量子點－蛋白質(zhì)熒光猝滅效應的相關應用提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1．1 試劑與儀器

碲粉、硼氫化鈉、氯化鎘、N－乙酰基－L－半胱氨酸（分析純，阿拉丁試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；高純氮氣（＞99．999%，山西宜虹工業(yè)氣體有限公司）；牛血清白蛋白（99%，華美生物工程公司）；細胞色素c（95%，Sigma）；三（羥甲基）氨基甲烷（分析純，美國AMRESCO）。

Varian－Cary 4000紫外分光光度計（美國瓦里安公司）；Varian－Cary Eclipase熒光分光光度計（美國瓦里安公司）；TE214S電子天平（德國賽多利斯科學儀器公司）；Delta 320型酸度計（瑞士Mettler Teledo）；JEM－2100透射電子顯微鏡（日本JEOL）；FTIR－8400傅立葉變換紅外光譜儀（日本島津）；JASCO 810圓二色譜儀（日本JASCO）。

1．2 CdTe量子點和CdTe／CdS核殼量子點的制備

按照參考文獻所述方法［23］并加以改進，制備量子點。去離子水中，將NaBH4與Te粉以摩爾比2∶1反應制備NaHTe。冰水浴中，將20mL CdCl2溶液（12．5mmol／L）用去離子水稀釋到170 mL，向其中注入20mL NAC溶液（30mmol／L）。用1．0mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)該前驅(qū)體溶液pH值為9．5。冰水浴中，通N2氣30min。劇烈攪拌下，向其中迅速加入0．4mL NaHTe溶液（300 mmol／L）?？刂艭d∶Te∶NAC的摩爾比約為1．0∶0．5∶2．4。將該橙黃色溶液轉移至襯有聚四氟乙烯內(nèi)膽的不銹鋼反應釜中，在220℃反應31～55min，得到不同粒徑的水溶性NAC穩(wěn)定的CdTe量子點。按文獻所述方法進行純化［23］。

稱取2．5mg Na2S固體溶解于5mL去離子水中備用。N2氣保護下將其注入20mL的CdTe量子點中，冰浴下攪拌10min，然后裝入不銹鋼反應釜中，放入220℃烘箱中。加熱一定時間后取出反應釜，得到NAC穩(wěn)定的CdTe／CdS核殼量子點。

1．3 細胞色素c對CdTe量子點和CdTe／CdS核殼量子點熒光的猝滅效應

移取2．0mL 1．2×10－6mol／L不同粒徑的CdTe量子點或CdTe／CdS核殼量子點的Tris－HCl溶液（0．05mol／L，pH 值為7．4）至1cm的比色皿中，10min后記錄熒光光譜。每隔10min向上述溶液中加入適量的1．0×10－5mol／L Cyt c水溶液，搖勻，10min后測定熒光光譜。

1．4 CdTe量子點對牛血清白蛋白熒光的猝滅效應

移取2．0mL 3．0×10－6mol／L BSA的 Tris－HCl溶液 （0．05mol／L，pH 值為7．4）至1cm的比色皿中，10min后記錄熒光光譜。每隔10min向上述溶液中加入適量的4．0×10－5mol／L CdTe量子點水溶液，搖勻，10min后測定熒光光譜。同樣步驟向含有緩沖液的4．0×10－7mol／L CdTe量子點中加入不同濃度的BSA，測定其熒光光譜。

1．5 溫度對CdTe量子點與牛血清白蛋白的熒光猝滅效應的影響

移取2．0mL 3．0×10－6mol／L BSA的 Tris－HCl溶液（0．05mol／L，pH 值為7．4）至1cm 的比色皿中，分別在20℃、25℃和30℃下恒溫，10min后以280nm光激發(fā)進行熒光測定，然后每隔10min，向上述溶液中加入一定濃度的CdTe量子點儲備液，分別考察20℃、25℃和30℃下的CdTe量子點對BSA的猝滅作用。

1．6 圓二色譜表征CdTe量子點對牛血清白蛋白構象的影響

向5．0×10－6mol／L BSA 溶液中，加入一定體積的CdTe量子點儲備液，使其終濃度依次為0、4．0×10－8和2．0×10－7mol／L。圓二色譜由CdTe QDs－BSA結合物的橢偏率扣除同一波長下CdTe量子點的橢偏率而得到。

以上所有光譜測定均重復3次，除指明外，均在室溫下進行。

2 結果與討論

2．1 CdTe量子點的結構及光譜性質(zhì)

圖1 （A）CdTe量子點的紫外可見吸收光譜圖，（B）歸一化的CdTe量子點熒光光譜圖，（C）紫外燈照射下發(fā)射不同波長熒光的CdTe量子點，（D）CdTe量子點的透射電鏡圖

圖1A是不同粒徑的CdTe量子點溶液的紫外－可見吸收光譜。1至7號樣品的吸收峰分別位于416、501、534、548、579、592和606nm。樣品的第一激子峰峰位從416nm顯著紅移至606nm，表明量子點的粒徑在逐漸增大。圖1B是相同樣品在350nm光激發(fā)下的歸一化熒光光譜圖。1至7號樣品的發(fā)射峰分別位于493、539、563、572、615、632和665nm，發(fā)射峰窄而對稱，且隨著發(fā)射波長的增長，半峰寬從21nm逐漸增大到70nm。圖1C表示在紫外燈（254nm）照射下，隨著CdTe量子點粒徑的增大（從左至右），顏色由綠色逐漸變?yōu)辄S色和紅色。圖1D是黃色CdTe量子點的高分辨透射電鏡圖，顯示CdTe量子點形狀近似球形，具有明顯的晶格條紋，粒徑約2～4nm，與基于紫外可見吸收光譜的計算結果2．44nm相吻合。

圖2是NAC和CdTe量子點的傅里葉變換紅外光譜圖。NAC在2547cm－1處具有S—H的特征伸縮振動峰，而CdTe量子點則沒有此峰。從圖中還可看出，在1038cm－1附近保留了C—S的吸收峰，在3434cm－1處有羧羥基—OH 峰，1597～1653cm－1處有羰基峰，2900cm－1處有N—H的譜峰，說明穩(wěn)定劑NAC主要是由巰基中的S與CdTe中的Cd進行配位形成Cd—S鍵而與量子點結合的，表明NAC已包覆到CdTe量子點表面，發(fā)揮穩(wěn)定量子點的作用。綠、黃、紅CdTe量子點的結構及光譜性質(zhì)數(shù)據(jù)歸納于表1中。表中CdTe量子點的粒徑根據(jù)Peng［24］的經(jīng)驗公式計算得到：

圖2 NAC和CdTe量子點的傅里葉變換紅外光譜圖

表1 綠、黃、紅CdTe量子點的結構及光譜性質(zhì)Structure and spectral properties of green，yellow and red CdTe QDs

式中，D（nm）為CdTe量子點的直徑，λ（nm）為紫外－可見吸收光譜中CdTe量子點第一激子吸收峰的峰位。量子點的熒光性能用量子產(chǎn)率Yu來表征。按文獻［25］所述方法，利用下式計算得到Yu：

式中，Yu和Ys分別表示樣品和標準物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，F(xiàn)u和Fs分別表示樣品和標準物質(zhì)的積分熒光強度，Au和As分別表示樣品和標準物質(zhì)對該波長激發(fā)光的吸光度。由表1中結果可知，隨著反應時間的延長，CdTe量子點的粒徑逐漸變大，吸收峰和發(fā)射峰隨著粒徑的增大逐漸紅移，顏色由綠到黃、紅色，半峰寬（FWHW）逐漸增大。

2．2 細胞色素c對CdTe量子點的熒光猝滅效應及其機理

2．2．1 Cyt c對不同粒徑CdTe量子點熒光的猝滅效應

由圖3可知，在加入Cyt c之前，不同粒徑的A、B、C三種CdTe量子點在350nm光激發(fā)下，其熒光發(fā)射峰分別位于514、546、601nm。隨著體系中Cyt c的濃度逐漸升高，三種量子點的熒光強度都持續(xù)下降。當體系中Cyt c濃度達到1．8×10－7mol／L時，A、B、C三種量子點的熒光強度分別下降了64%、53%、47%，表明Cyt c對量子點的熒光猝滅效應隨著量子點粒徑的減小而增強。當Cyt c濃度在0～3．0×10－7mol／L范圍內(nèi)時，量子點的熒光猝滅強度F0／F（F0為量子點的初始熒光強度，F(xiàn)為加入Cyt c后量子點的熒光強度）與Cyt c的濃度成線性關系（見圖4C，其中的直線為綠色量子點的情形，黃色和紅色量子點的F0／F－［Cyt c］圖與之類似）。同時，發(fā)射峰位都發(fā)生了微小的藍移，分別從514nm移至512nm、546nm移至541nm、601nm移至599nm。量子點熒光的顯著猝滅和發(fā)射峰位置的微小藍移，表明二者之間發(fā)生了較強烈的作用。

圖3 Cyt c對不同粒徑的綠（A）、黃（B）、紅（C）CdTe量子點的熒光猝滅效應Cyt c的濃度［Cyt c］1～ 6：0，6，9，12，15，18（×10－8 mol／L）。［CdTe QDs］＝1．2×10－6 mol／L，pH ＝ 7．4，λex＝350nm

根據(jù)量子點的基本性質(zhì)，對上述現(xiàn)象可作以下解釋：

1）從量子點的表面效應角度理解。隨著量子點粒徑的減小，其表面原子迅速增加，導致原子配位不足和高的表面能。具有懸掛鍵的表面原子會引入表面態(tài)，具有高的活性，極易與其他原子結合。所以，粒徑較小的綠色量子點與Cyt c的表面結合作用較強。同時，處于激發(fā)態(tài)的載流子極易以非輻射躍遷方式弛豫到表面態(tài)。因此，以表面態(tài)為橋梁，受激電子被表面所結合的Cyt c捕獲的幾率大為提高，表現(xiàn)為較強的熒光猝滅效應。與綠色量子點相比，黃、紅色量子點的粒徑較大，表面能較低，處于表面態(tài)的原子數(shù)較少，一方面導致Cyt c與量子點的表面結合作用較弱，另一方面弛豫到表面態(tài)原子的受激電子數(shù)較少，因而使Cyt c

式中Eg為體相帶隙，R為量子點半徑，μ為電子和空穴的折合質(zhì)量，ε2為體相介電常數(shù)。一般地，當R小于激子波爾半徑時，1／R2項（動能項）的貢獻大于1／R項（庫倫項），E（R）隨R的減小而增大，粒子顯示出較強的量子限域效應。表面極化項（small polarization term）通常較小。根據(jù)公式（3），隨著量子點半徑R的減小，最低激發(fā)能E（R）增大，處于導帶的受激電子的動能增大，被結合于捕獲受激電子的幾率降低，表現(xiàn)為較弱的熒光猝滅效應。

2）從量子點的量子限域效應角度理解。量子限域效應可用有效質(zhì)量近似理論來定量描述。量子點的最低激發(fā)能E（R）可表示為［26］：量子點表面的Cyt c捕獲的幾率提高。

2．2．2 Cyt c對CdTe量子點和 CdTe／CdS核殼量子點的熒光猝滅效應比較及機理

圖4 Cyt c對綠色CdTe量子點 （A）和綠色CdTe／CdS核殼量子點 （B）的熒光猝滅效應（C）Cyt c猝滅CdTe量子點和CdTe／CdS核殼量子點熒光的Stern－Volmer圖

由圖4A和4B可知，在350nm光激發(fā)下，隨著濃度的增加，Cyt c對綠色CdTe量子點和CdTe／CdS核殼量子點都有顯著熒光猝滅作用。當加入Cyt c濃度為1．35×10－7mol／L時，綠色CdTe量子點的熒光強度由254降低到132，降低了48%，而綠色CdTe／CdS核殼量子點其熒光強度由648降低到241，降低了63%。同時，發(fā)射峰位從514nm略微藍移至512nm。由圖4C可知，當Cyt c的濃度大于1．0×10－7mol／L 時，其對CdTe／CdS核殼量子點的猝滅效應強于CdTe量子點。

細胞色素c的等電點為9．79，在pH值為7．4的Tris－HCl緩沖溶液中，細胞色素c帶正電，易與帶負電的量子點結合。熒光猝滅機理可以描述為光誘導的電子傳遞過程。光照射下，量子點內(nèi)的電子受激發(fā)由價帶躍遷到導帶。結合于量子點表面的Cyt c（Ⅲ）可以直接截獲受激電子轉變?yōu)镃ytc（Ⅱ），從而阻止了受激電子與量子點內(nèi)空穴的輻射復合，使量子點的熒光猝滅。

熒光猝滅的可能機理如下：

兩種量子點的熒光猝滅效果之所以不同，是因為兩種量子點的結構不同所導致的電子結構的差異。當CdTe外加CdS殼后，具有較大帶隙的CdS殼對CdTe核的電子結構會產(chǎn)生一定的微擾，由于二者的最低未占據(jù)分子軌道（LUMOs）的能量較為接近，因此可以充分交疊融合，從而使核殼結構的LUMOs可以在整個量子點內(nèi)離域；而二者的最高占據(jù)分子軌道（HOMOs）的能量相差較大，較少交疊，因此核殼結構的HOMOs是類似于核的HOMOs并定域于核。其結果是核殼結構的第一激發(fā)態(tài)的電子與空穴的復合將主要發(fā)生于核內(nèi)。由于空穴被限域于核，而受激電子可在整個核殼結構中離域，從而使受激電子與空穴在量子點表面復合的幾率大為降低，相應地，受激電子在量子點表面被Cyt c捕獲的幾率則大為提高。因此，光誘導的電子轉移對于核殼結構的量子點而言更容易發(fā)生?；谝陨贤茢啵衫昧捷^小的綠色CdTe／CdS核殼量子點作為熒光探針定量檢測細胞色素c。

2．3 CdTe量子點對牛血清白蛋白的熒光猝滅效應及其機理

研究了CdTe量子點對BSA熒光的猝滅效應（圖5A）。以280nm的光激發(fā)BSA，其熒光發(fā)射峰位于343nm。隨著CdTe量子點濃度的增加，BSA的熒光強度不斷降低，表明CdTe量子點可以顯著猝滅BSA的熒光。

根據(jù)校正的Stern–Volmer方程［27］，

其中，F(xiàn)0為未加量子點時的熒光強度，F(xiàn)為加入不同濃度量子點后的熒光強度，K為熒光猝滅常數(shù)，［Q］為猝滅劑濃度，fa為BSA中熒光猝滅分數(shù)。作圖（見圖5B），直線的截距為斜率為由此可求出不同溫度下CdTe量子點對BSA的猝滅常數(shù)K（見表2）。

表2 CdTe量子點對BSA的猝滅常數(shù)Quenching constants of BSA by CdTe QDs

由圖5B和表2可知，量子點對BSA的熒光有較強的猝滅作用。猝滅常數(shù)隨著溫度的升高逐漸減小，且在0～2．4×10－6mol／L范圍內(nèi)，BSA的熒光猝滅強度與量子點的濃度成線性關系。熒光猝滅可由靜態(tài)猝滅過程或動態(tài)猝滅過程引起，兩種猝滅過程有著不同的溫度依賴性：溫度升高，靜態(tài)結合物穩(wěn)定性降低，導致結合常數(shù)降低，而動態(tài)猝滅則隨溫度上升，分子熱運動增加，結合常數(shù)增加。因此，CdTe量子點對BSA的熒光猝滅屬靜態(tài)猝滅過程。

圖5C利用圓二色譜考察了BSA結合CdTe量子點前后的溶液構象變化。在pH值為7．4的溶液中，游離BSA的CD譜顯示出蛋白α－螺旋結構的特征譜帶，即在UV區(qū)208nm和222nm處出現(xiàn)特征的負譜帶。CdTe量子點的結合則導致BSA所有波長的負橢偏率的減少以及峰位的些微移動，表明CdTe量子點誘導下BSA的α－螺旋含量有所下降。類似地，有文獻報道［23］porphyrin同人血清白蛋白的結合可導致蛋白的α－螺旋含量的減小。本研究中，依據(jù)CdTe量子點所導致的蛋白α－螺旋含量的減少，我們推測CdTe量子點的結合可使BSA的二級結構發(fā)生一定程度的松散，增大了BSA內(nèi)疏水性色氨酸熒光團的溶劑暴露程度，從而猝滅了BSA的熒光。

2．4 BSA對CdTe量子點的熒光增強效應

研究了BSA對CdTe量子點熒光的增強效應（圖6）。以350nm的光激發(fā)濃度為4．0×10－7mol／L的綠色CdTe量子點，其熒光發(fā)射峰位于514nm。隨著CdTe量子點體系中BSA濃度的增加，量子點的熒光強度逐漸增強至初始強度的約2倍。這可能是由于BSA與量子點表面原子發(fā)生配位等作用，減少了量子點的表面缺陷，從而增強了量子點的熒光發(fā)射強度。

圖5 （A）CdTe量子點對BSA （3．0×10－6 mol／L）的熒光猝滅效應：25℃，pH＝7．4，λex＝280nm，［QDs］1～17：0，0．3 ，0．9，1．35，2．25，3．0，4．5，6．0，7．5，9．0，10．5，12．0，13．5，15．0，16．5，19．5，24．0（×10－7 mol／L）；（B）20℃、25℃和30℃時CdTe量子點猝滅BSA熒光的校正的Stern－Volmer圖；（C）QDs與BSA相互作用的圓二色譜：25℃，pH＝7．4，（1）5．0×10－6 mol／L BSA，（2）5．0×10－6 mol／L BSA＋4．0×10－8 mol／L QDs，（3）5．0×10－6 mol／L BSA ＋2．0×10－7 mol／L QDs

3 結論

本文利用水熱法合成了不同粒徑的NAC穩(wěn)定的CdTe量子點及核殼結構CdTe／CdS量子點，分別研究了細胞色素c對CdTe量子點及CdTe／CdS核殼量子點熒光的猝滅效應和CdTe量子點對牛血清白蛋白熒光的猝滅效應。研究表明，細胞色素c通過受激電子表面?zhèn)鬟f機理，對粒徑較小或具有核殼結構的CdTe量子點具有較強的熒光猝滅能力。CdTe量子點通過松散BSA的螺旋結構，使BSA的疏水性色氨酸熒光團的溶劑暴露程度增大，從而猝滅其熒光。同時，BSA與CdTe量子點的表面原子發(fā)生配位等作用，可減少CdTe量子點的表面缺陷，從而增強CdTe量子點的熒光發(fā)射強度。

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