體外受精-胚胎移植技術(shù)在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠繁育中的應(yīng)用

呂相川, 張婀娜, 周生來, 王 惟, 于 洋, 鄭志紅

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部遼寧省轉(zhuǎn)基因研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽110001)

體外受精-胚胎移植技術(shù)在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠繁育中的應(yīng)用

呂相川, 張婀娜, 周生來, 王 惟, 于 洋, 鄭志紅

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部遼寧省轉(zhuǎn)基因研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽110001)

目的 研究體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠繁育中的應(yīng)用。方法 分別應(yīng)用自然交配與體外受精方法進(jìn)行APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因繁育，比較受精率及產(chǎn)仔數(shù)量;腹腔注射PMSG-HCG超排雌性C57BL/6小鼠，分別與12周齡、24周齡、36周齡、52周齡、72周齡的成年雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行體外受精，將獲得的2-細(xì)胞胚胎移植到假孕雌鼠的輸卵管，通過PCR方法對(duì)仔代小鼠進(jìn)行鑒定。結(jié)果 6只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠與18只野生型雌性小鼠自然方式交配，實(shí)驗(yàn)周期為21 d，獲得胚胎的受精率為73.3%。應(yīng)用體外受精的方法用1只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠的精子與18只雌性野生型小鼠的胚胎進(jìn)行體外受精, 受精率達(dá)到95%, 實(shí)驗(yàn)周期為4 d。兩種繁育方式產(chǎn)仔數(shù)量陽性小鼠數(shù)量有顯著差異(P＜0.05), 陽性率無顯著性差異(P＞0.05)。12周齡、24周齡、36周齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的體外受精結(jié)果顯示，三種不同周齡的雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠受精率、產(chǎn)仔數(shù)量及陽性率均無顯著性差異（P＞0.05）。對(duì)應(yīng)用常規(guī)繁育方法難以獲得后代的老齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(52周齡、72周齡)體外受精率分別為85.6%、84.1%，獲得陽性后代18只和14只。結(jié)論 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠可以采用IVF-ET技術(shù)進(jìn)行繁育，為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠快速擴(kuò)大繁育提供一種新方式。

小鼠; 體外受精-胚胎移植(IVF-ET); 阿爾茲海默病; 擴(kuò)大繁育

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)屬于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病, 是導(dǎo)致老年癡呆的主要原因, 該病的病因尚不明確[1～2]。APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型能夠在腦內(nèi)復(fù)制人類阿爾茲海默病的重要病理特征, 如Aβ老年斑沉積, Morris水迷宮測(cè)試中出現(xiàn)記憶力障礙等, 是研究阿爾茨海默病的理想模型。

本實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)TG(APPswe,PSEN1De9)85Dbo/J轉(zhuǎn)基因雜合體種鼠進(jìn)行繁殖。由于種鼠為雜合體, 所以在使用前必須進(jìn)行基因型檢測(cè); 為了滿足研究人員可以快速獲得大量的、同周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠, 本實(shí)驗(yàn)將體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)應(yīng)用到APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠繁育中, 為探索一種新的的轉(zhuǎn)基因小鼠繁育方式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及繁育

雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠引自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)J005864。SPF級(jí)成年雌性C57BL/6J小鼠、ICR小鼠來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SCXK(遼)2008-0005]，飼養(yǎng)條件: 溫度控制在(22±3)℃，自動(dòng)光控(12 h/12 h)。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠常規(guī)繁育方式為雄性雜合子×雌性野生型飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 試劑及儀器

孕馬血清(PMSG，寧波市激素制品廠)、人絨毛膜促性腺激素(hCG，上海生物化學(xué)制藥廠)、礦物油、M2,M16培養(yǎng)液(Sigma生產(chǎn))，HTF培養(yǎng)液購(gòu)買于日本株式會(huì)社，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自三洋公司，體式顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS，蛋白酶K、DNA聚合酶、瓊脂糖購(gòu)自Takara公司，引物序列合成于三博遠(yuǎn)志公司。

1.3 自然交配

對(duì)24周齡雄性轉(zhuǎn)基因小鼠和8周齡雌性野生型小鼠按照雄性雜合子與雌性野生型自然交配方法1∶1或者1∶2進(jìn)行繁育作為參照數(shù)據(jù)。

1.4 體外受精

1.4.1 精子的采集[3～6]對(duì) 12 周齡、24 周齡、36 周齡、52周齡、72周齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分別取其附睪尾，沿與曲細(xì)精管垂直方向剪口，用滅菌的解剖針從附睪尾不挑取一滴濃密的精液，放入已預(yù)培養(yǎng)的HTF培養(yǎng)液中, 于CO2培養(yǎng)箱37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)獲能1.5 h，并以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)該精子懸濁液的濃度。

1.4.2 超排卵與取卵[7]取4周齡的雌性C57BL/6J小鼠，腹腔注射PMSG 5 IU/只，間隔48 h后再次腹腔注射hCG 5 IU/只，于腹腔注射hCG 14 h后取卵，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪下輸卵管放入礦物油中，在輸卵管膨大處用解剖針劃破，將卵母細(xì)胞團(tuán)滑入150 μl HTF 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.4.3 2-細(xì)胞吹卵 將自然交配見栓的雌鼠于見栓1.5 d后取其輸卵管，將輸卵管放入100 μl M2培養(yǎng)液，用1 ml注射器吸取足量的M2培養(yǎng)液，套上灌流針，在實(shí)體解剖鏡下用灌流針插入輸卵管傘部，推動(dòng)注射器栓,沖洗輸卵管2～3次，2-細(xì)胞受精卵將迅速沉至培養(yǎng)皿底部，用吸卵管吸取受精卵在M16洗3次后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.4 體外受精(IVF) 將適量獲能后的精子分別放入含未受精卵的培養(yǎng)液中(每滴含未受精卵80～100個(gè))，使其精子終濃度為200個(gè)/μl, 然后放入CO2培養(yǎng)箱中受精6 h。

1.4.5 受精卵的鑒定 體外受精6 h候后在實(shí)體顯微鏡下觀察受精情況, 將有二極體和雙原核的卵判定為受精卵。計(jì)算受精率, 次日觀察2-細(xì)胞發(fā)育率。

1.5 胚胎移植(ET)[8]

1.5.1 假孕母鼠的制備 取10周齡左右的ICR雌性小鼠在移植前1 d下午與結(jié)扎雄鼠進(jìn)行交配，次日早上觀察到陰道栓的為假孕0.5 d的小鼠。

1.5.2 2-細(xì)胞受精卵的移植 稱重假孕雌鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射將其麻醉，酒精消毒后剪背腎部毛，在髂骨和腎臟下方剪一縱切口，引出卵巢、輸卵管、子宮，將輸卵管包膜剪開一個(gè)小口，看清輸卵管傘部的走向，將移卵管從傘部插入輸卵管2～3 mm，將受精卵吹入壺腹部，略停片刻后再拔出。將卵巢、輸卵管、子宮復(fù)位，最后縫合創(chuàng)口。精心飼養(yǎng)，記錄產(chǎn)仔數(shù)量。

1.6 鼠尾基因組DNA的提取

剪取仔鼠鼠尾0.5 cm，用酚氯仿方法提取鼠尾基因組DNA，用于PCR檢測(cè)。

1.7 PCR檢測(cè)

PCR檢測(cè)引物Tg(PS1)引物序列為primer1:5′AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA 3′，primer2:5′GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT 3′，產(chǎn)物大小608 bp; Tg(APP)引物序列為primer1: AGG ACT GAC CAC TCG ACC AG 3′，primer2: 5′CGG GGG TCT AGT TCT GCA T 3′, 產(chǎn)物大小 377 bp。反應(yīng)條件為94℃ 5 min, 94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s, 32個(gè)循環(huán), 72℃10 min, PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS軟件，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 繁育結(jié)果

自然交配過程中, 使用了6只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠與18只野生型雌性小鼠交配(1∶1交配, 實(shí)驗(yàn)3次),實(shí)驗(yàn)周期為21 d，獲得2-細(xì)胞發(fā)育率只有73.3%。應(yīng)用體外受精的方法只用1只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠的精子與18只雌性野生型小鼠的胚胎在IVF，2-細(xì)胞發(fā)育率達(dá)到95%，實(shí)驗(yàn)周期僅為4 d(表1)。另使用6只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠與12只野生型雌性小鼠交配(1∶2交配，實(shí)驗(yàn)1次), 實(shí)驗(yàn)周期為56 d，應(yīng)用IVF的方法只用1只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠的精子與12只雌性野生型小鼠的胚胎在IVF，實(shí)驗(yàn)周期為54 d，2種繁育方式的產(chǎn)仔數(shù)量、陽性小鼠數(shù)量有顯著差異(P＜0.05)(表 2)。

2.2 不同周齡雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠IVF結(jié)果

對(duì)12周齡、24周齡、36周齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠分別與30只C57BL/6J雌鼠進(jìn)行體外受精, 實(shí)驗(yàn)周期54 d(表3), 三種不同鼠齡的雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠受精率、產(chǎn)仔數(shù)量及陽性率均無顯著性差異(P＞0.05), 體外受精平均達(dá)到94.56%。

另對(duì)常規(guī)繁育方法無法正常獲得后代的老齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(52周齡、72周齡)分別與10只C57BL/6J雌鼠采用體外受精、胚胎移植的方法進(jìn)行繁育，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期54 d，體外受精率分別達(dá)到85.6%、84.1%。分別選取120枚胚胎，移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，均獲得陽性后代。

2.2 子代APP轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測(cè)結(jié)果

鼠尾基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖凝膠電泳，部分結(jié)果見圖1。

表 1 兩種方法小鼠繁育受精率的結(jié)果

表 2 兩種方法繁育小鼠結(jié)果

表 3 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因最適繁育年齡段雄鼠IVF-ET植結(jié)果

表 4 老齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠IVF繁育結(jié)果

圖 1 APP基因PCR檢測(cè)

圖 2 PSEN1基因 PCR檢測(cè)

3 討論

目前，隨著基因功能研究的進(jìn)展，從生物整體水平進(jìn)行基因功能研究已經(jīng)成為科學(xué)研究發(fā)展的趨勢(shì)。各種人類疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，為研究疾病的發(fā)病機(jī)制及疾病治療提供了的理想的實(shí)驗(yàn)材料。與此同時(shí)，這些模型鼠的保種和繁育在科學(xué)研究中顯得尤為重要。

自從1968年Whittingham最先報(bào)道了小鼠體外受精獲得后代以來，許多研究者進(jìn)行了大量的研究[9～11]。目前小鼠體外受精技術(shù)已日臻完善, IVF-ET是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的重要手段之一，在國(guó)外早已廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因小鼠的擴(kuò)大繁育、升級(jí)凈化、品系快速回交、胚胎冷凍保種等方面。本研究將小鼠IVF-ET技術(shù)應(yīng)用到不同周齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育中去，目前國(guó)內(nèi)對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠繁育與IVF-ET相結(jié)合還未見報(bào)道。

當(dāng)前引進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)繁育主要面臨的問題:①引種至繁殖出大量的實(shí)驗(yàn)用小鼠周期較長(zhǎng)，同時(shí)提供大量的同齡陽性小鼠較困難; ②常規(guī)繁殖方式維持生產(chǎn)需要大量的人力、消耗大量的經(jīng)費(fèi)，占據(jù)大量的空間; ③有的疾病模型小鼠出現(xiàn)生育障礙，比如傳代困難(如少精、偏癱等小鼠模型)。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為理想的阿爾茲海默病的動(dòng)物模型, 生殖能力幾乎與背景品系C57BL/6J一致, 常規(guī)的繁育方法可以滿足品系保種的要求, 但隨著阿爾茲海默病的研究越來越深入, APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠使用量劇增，實(shí)驗(yàn)人員對(duì)鼠的要求越來越嚴(yán)格等原因?qū)е聠我坏某Ｒ?guī)繁育方式往往不能滿足實(shí)驗(yàn)者的需求。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 12～36周齡的雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠均可以在2個(gè)月內(nèi)通過IVF-ET技術(shù)獲得大量同周齡、同性別APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，適用于不同要求的科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，減少常規(guī)繁育的飼養(yǎng)壓力。

在日常繁育過程中經(jīng)常會(huì)遇到模型小鼠老齡化、繁育能力低下等問題，在本實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)52周齡和72周齡老齡雄鼠進(jìn)行了IVF-ET繁育方式,52周齡和72周齡的雄鼠經(jīng)過體外受精后均獲得陽性后代。通過IVF-ET可以更好保存模型動(dòng)物的資源，解決老齡化小鼠無法通過正常繁育獲得后代的弊端, 防止模型資源丟失, 起到品系營(yíng)救的目的。

常規(guī)繁育方式和IVF-ET兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)。本研究經(jīng)過常規(guī)繁育與體外受精方式繁育進(jìn)行了比較, 常規(guī)繁育操作方法簡(jiǎn)單, 但是存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、受精率低等問題, 而且需要大量的人力、物力和飼養(yǎng)空間, 但提供實(shí)驗(yàn)鼠的鼠齡不一致或數(shù)量相對(duì)較少。IVF-ET技術(shù)可以用1～2只雄性轉(zhuǎn)基因小鼠就可以實(shí)現(xiàn)在同一時(shí)間內(nèi)能提供較大量的同周齡轉(zhuǎn)基因動(dòng)物, 同時(shí)又解決了老齡生殖障礙的模型鼠的繁育保種問題, 節(jié)省飼養(yǎng)空間, 減少飼養(yǎng)成本, 更適用于動(dòng)物模型的大量繁育與保種。

綜上所述, IVF-ET技術(shù)可以應(yīng)用到APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的保種繁育中, 并且豐富了該品系模型鼠的繁育方法。體外受精及胚胎移植技術(shù)在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型中的成功應(yīng)用不僅實(shí)現(xiàn)繁育方法的多樣化, 也為其它模型小鼠的繁育提供了新的思路。

[1] Morgan CD, Nordin S, Murphy C. Odor identification as an early marker for Alzheimer’s disease : impact of lexical functioning and detection sensitivity[J]. J Clin Exp Neuropsychol,1995, 17(5):793-803.

[2] Koss E, Weiffenbach JM, Haxby JV, et al. Olfactory detection and identification performance are dissociated in early Alzheimer’S disease [J]. Neurology, 1988, 38(8):1228-1232.

[3] Nakagata N.High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification[J]. J Reprod Fertil, 1989, 89:479-483.

[4] Nakagata N.Cryopreservation of mouse spermatozoa[J]. J Mamm Ova Res, 2000, 17(1):1-8.

[5] Nakagata N, Takeshima T. Cryopreservation of mouse spermatozoa from inbred and F1 Hybrid strains[J]. Exp Anim, 1993, 42(2):317-320.

[6] 史曉平, 董婉維, 周生來, 等. FVB小鼠精子冷凍機(jī)體外受精的研究[J]. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 3:35-37.

[7] 吳紅, 謝夏陽, 孫強(qiáng), 等. 小鼠卵子不同獲取時(shí)間和處理對(duì)體外受精率和受孕率的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2003,11(3):160.

[8] 卡爾 A 平克爾特.(勞為德譯). 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)手冊(cè)[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004:19-21.

[9] 李敦高, 蔣滿喜, 陳學(xué)進(jìn), 等. 一種以小鼠精子為主導(dǎo)的綜合性保種體系[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2012, 32(2):142-145.

[10] 劉麗均, 朱權(quán)鳳, 郁麗麗, 等. 激光打孔技術(shù)用于冷凍精子復(fù)蘇后體外受精的研究[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2012,32(3):203-208.

[11] 王芊芊, 陳瑜. 小鼠胚胎單側(cè)與雙側(cè)輸卵管移植的結(jié)果比較[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2012, 32(5):414-415.

Application of in Vitro Fertilization and Embryo Transfer in Breeding of APP/PSEN1 Double Transgenic Mice

Lü Xiang-chuan, ZHANG E-nuo ZHOU Sheng-lai, YU Yang,WANG Wei, ZHANG Mei-ying, ZHENG Zhi-hong
(Laboratory Animal Center, China Medical University, Shenyang 110001, China)

To study the techniques of in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer applied for breeding APP/PS1 double transgenic mice.MethodsThe fertilization rates and birth rates were analyzed in both natural mating group and IVF group for breeding APP/PS1 double transgenic mice. The female C57BL/6 mice were given intraperitoneal injection of appropriate dose of PMSG-hCG. The super ovulation oocytes were collected for IVF with sperms which were taken from 12 weeks, 24 weeks,36 weeks, 52 weeks and 72 weeks old APP/PS1 double transgenic male mice respectively. The 2-cells embryos were than transfer to the fallopian of pseudopregnant mice. The genotypes of newborn mice were identified by PCR.ResultsThe fertilization rates were 73.3% in group of natural mating, but 95%in group of IVF. The statistic differentiation was significant in newborn mice number (P＜0.05) between natural crossing group to IVF group, but was not marked in genotype positive rate (P＞0.05). The fertilization rates, birth rates and genotype positive rate were evaluated in 12 weeks, 24 weeks, and 36 weeks old APP/PS1 double transgenic male mice by statistic analysis which showed that there were no significant difference among them (P＞0.05 ). The IVF rates were 85.6%, 84.1% in 52 weeks,and 72 weeks old APP/PS1 double transgenic male mice those were so aging enough that could not breed the filial generation by usual method.ConclusionThe application the techniques of IVF-ET can enlarge rapidly the breeding population of APP/PS1 double transgenic mice.

Mouse; IVF-ET; Alzheimer′s disease; Expanded breeding

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0140-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.012

2013-10-24

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2010232006)

呂相川(1984-), 男, E-mail: dream04lv@163.com

鄭志紅, 教授, E-mail: zhihongzheng@163.com