獼猴微衛(wèi)星標記的遺傳分析

楊 娜, 劉曉帥, 周 亮, 曾代文

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所, 成都 610212)

獼猴微衛(wèi)星標記的遺傳分析

楊 娜, 劉曉帥, 周 亮, 曾代文

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所, 成都 610212)

目的 人工繁育獼猴所面臨的最大問題是繁殖群體過小所導(dǎo)致的近親交配, 為了防止近親交配帶來的不利影響，采用微衛(wèi)星分子標記建立獼猴人工繁殖種群的準確系譜非常重要。方法 本研究采用熒光標記引物PCR和毛細管電泳分型的方法將篩選出的14個微衛(wèi)星位點應(yīng)用于64只獼猴人工繁育種群，并通過個體鑒別、親子鑒定以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的方法對其進行評價。結(jié)果 這些位點在獼猴中均屬于高度多態(tài)位點，其中7個位點的期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)值均在0.8以上，14個位點的累計個體鑒別率(CPI)為1.21×10-18，單親已知時累積排除率(CPE2)和雙親未知時累積排除率(CPE1)可達0.9999和0.9985。結(jié)論 這些位點能夠?qū)ΛJ猴種群進行準確的個體鑒別、親子鑒定和群體遺傳學(xué)參數(shù)計算，是可靠、高效的分子標記，或可應(yīng)用于獼猴人工飼養(yǎng)種群的遺傳學(xué)管理。

獼猴; 微衛(wèi)星; 遺傳學(xué)控制

遺傳學(xué)控制在實驗動物的管理中起著至關(guān)重要的作用，它不僅影響實驗數(shù)據(jù)的可靠性，還直接影響著種群的生存與繁殖能力能否長期延續(xù)。目前，我國對大、小鼠的遺傳質(zhì)量標準和檢測方法都有明確的規(guī)定，但是對非人靈長類實驗動物的遺傳管理還未做要求。

微衛(wèi)星DNA是目前普遍使用的分子遺傳學(xué)標記, 我國已成功將其應(yīng)用于各類實驗動物如, 大、小鼠、家兔、比格犬和小型豬[1～5]的遺傳質(zhì)量檢測, 同時國外的研究者采用多個高度多態(tài)的人源[6]或猴源[7]微衛(wèi)星位點對非人靈長類動物實施了有效的遺傳學(xué)控制, 包括個體識別[8]、血緣系譜的建立[9]以及種群遺傳分析[10]。由于國外所使用的獼猴大多來源于印度, 而微衛(wèi)星的多態(tài)性要受到地域的影響, 因此這些位點在我國獼猴中的應(yīng)用還需要系統(tǒng)的驗證。

本文采用PCR擴增和毛細管電泳分型的方法，從文獻報道的多態(tài)性好、分布廣的30個位點中篩選出了14個高度多態(tài)的位點，從群體遺傳結(jié)構(gòu)和個體遺傳背景的角度驗證了這些位點在我國獼猴遺傳學(xué)控制中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

獼猴(Macaca mulatta)64只(12只為野生馴養(yǎng)獼猴，捕獲于四川省涼山彝族自治州木里藏族自治縣, 52只為子一代), 其中雄性19只, 雌性45只, 體質(zhì)量2.5～13 kg, 年齡2～10歲[馴養(yǎng)繁殖許可證: 2004馴繁(21-01)號]。飼養(yǎng)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所[SYXK(川)2008-058], 前肢內(nèi)側(cè)頭靜脈或小隱靜脈采血1.5 ml, EDTA抗凝。

PCR反應(yīng)試劑(北京康為世紀生物科技有限公司); GeneScanTM500 LIZTM分子量標準(美國Applied Biosystems); 熒光標記引物(生工生物工程上海股份有限公司)。熱循環(huán)儀和水平電泳儀(美國BIO-RAD);遺傳分析儀(3130美國Applied Biosystems)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取新鮮血液中的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星標記 通過前期的預(yù)試, 選取了14個微衛(wèi)星位點[6～7](表1)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系:總體積20 μl，包括2×Taq Mix (含有Taq DNA Polymerase、2× Taq PCR Buffer、3 mmol/L MgCl2和 400 μmol/L dNTP mix) 10 μl、10 μmol/L 的上、下游引物各 0.8 μl、100 ng/μl的 DNA 模板 1 μl、超純水7.4 μl。PCR反應(yīng)程序: 預(yù)變性95℃ 5 min,變性94℃ 30 s, 退火55～58.5℃ 45 s, 延伸72℃ 45 s,共34個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

1.2.3 產(chǎn)物檢測 將PCR產(chǎn)物稀釋5倍，取2 μl與8 μl Hi-Di TM 甲酰胺和 1 μl內(nèi)標準片段混合, 95 ℃變性5 min后，經(jīng)ABI 3130測序儀進行電泳，圖像采用Genemap軟件分析，并進行人工校對，得到各微衛(wèi)星位點的基因型。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用POPGENE 1.32軟件計算各位點在獼猴人工繁育群中的觀察等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、表觀雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、群體內(nèi)近交系數(shù)(FIS); 采用Cervus3.0.3 計算多態(tài)信息含量(PIC)、雙親未知時排除率(PE1)、單親已知時排除率(PE2)、累積排除率(CPE)、個體鑒別率(PI)和累積個體鑒別率(CPI), 并進行Hardy-Weinberg平衡(HW)和無效等位基因頻率(F(Null))分析。

2 結(jié)果

14個微衛(wèi)星位點在64只獼猴中共檢測到 150個等位基因, 平均每個位點有10.7個等位基因; 所有位點的PIC值均大于0.6, 其中7個位點: D15S823、D13S765、D10S611、MML9S1、D03S1768、MML3S4和D09S921的He和PIC值均在0.8以上(表2); 同時群體雜合度(He)的平均值為0.813。

上述多態(tài)性最高的7個位點的PE2、PE1和PI也是最高的，其累積排除率CPE2和CPE1可達0.9995和0.9903，CPI為1.29×10-07; 所有14個位點的CPE2和CPE1則為0.9999和0.9985(表3)。

表 1 各位點PCR反應(yīng)引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小Table 1 Description of the primer sequences, PCR product size, and the annealing temperature for each locus

在其余多態(tài)性較低的位點中有4個位點:D07S794、D06S501、D01S548和D18S537偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05或P＜0.01，表2)。

5個位點:D15S823、D13S765、MML3S4、D11S2002、D05S1457的FIS和F(Null)均為正值(表2)。

3 討論

應(yīng)用微衛(wèi)星標記對靈長類實驗動物進行遺傳學(xué)控制在國外起步較早，但是各個實驗室所采用的標記都不完全相同，使得檢測結(jié)果不具有可比性，為了解決這一問題，Kanthaswamy等[6]從各個實驗室使用的大量標記中篩選出了15個高度多態(tài)的位點作為獼猴遺傳檢測控制的一組標準位點，本文所使用的位點主要來源于此。本次研究結(jié)果表明這些位點在我國獼猴中均屬于高度多態(tài)位點(當某微衛(wèi)星位點PIC＞0.5時，即表明該位點為高度多態(tài)位點[11])，這與雜合度分析結(jié)果相一致，表明目前本單位所建立的獼猴種群具有豐富的遺傳多樣性，采用這些親本組建繁殖單元有利于提高動物長期生存力和繁殖率。我國獼猴有6個亞種[12]，本單位飼養(yǎng)的為川西亞種，與福建亞種相比[13]，在位點D01S548上，兩者的He和PIC非常相近(He分別為0.742和0.749，PIC分別為0.697和0.695），在位點D03S1768上后者則略高于前者; 與海南亞種相比[14]，在位點D03S1768、D06S501和D10S611上川西亞種的多態(tài)性明顯高于海南亞種(等位基因數(shù): D03S1768，前者為14個，后者為7個; D06S501，前者為9個，后者為4個; D10S611，前者為12個，后者為4個）;由于川西亞種和福建亞種均屬于大陸型種群其基因交流多，因此基因多態(tài)性比較接近，而海南亞種位于比較孤立的島嶼上, 其與陸地基因幾乎沒有交流，導(dǎo)致它們的多態(tài)性遠遠低于川西亞種和福建亞種。目前，我國靈長類動物養(yǎng)殖研究單位已陸續(xù)采用微衛(wèi)星標記對其進行遺傳學(xué)檢測，但各單位使用的標記差別較大，同時由于我國獼猴亞種較多，使得不同單位的檢測結(jié)果不具有可比性，不利于靈長類實驗動物遺傳學(xué)控制的發(fā)展，因此對我國獼猴各亞種進行大樣本、多位點的篩選，建立其各自的標準遺傳檢測微衛(wèi)星位點是非常有必要的。

表 2 各位點在獼猴人工繁育群中的群體遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Heterozygosity, polymorphic information (PIC), and population genetics parametes for all loci at the captive colonies of rhesus macaques

表 3 各位點的親緣及個體鑒定參數(shù)Table 3 Powers of exclusion and genetic identity for all loci

個體鑒別率(PI)和累積個體鑒別率(CPI), 分別表示任意選取2只獼猴, 它們在一個特定位點和所有位點(本實驗中為14個)上具有相同基因型的概率。本實驗中14個位點的CPI值為1.21×10-18(表3),也就是說任意選取兩只獼猴，它們在所有14個位點上具有相同基因型的概率低于1/8.26×1017，使用這些位點，從理論上可以鑒別出8.26×1017只獼猴中的任意一只，而這個數(shù)量已經(jīng)遠遠超過了目前作者單位人工飼養(yǎng)獼猴的總量，這一結(jié)果與Kanthaswamy的研究結(jié)果[6]非常接近。說明本文所篩選出的微衛(wèi)星位點能夠?qū)θ斯わ曫B(yǎng)的獼猴進行特異的個體遺傳學(xué)鑒別。

累積排除率(CPE)是指一個任意選取的獼猴在所有位點上能夠被正確排除為一個任意選取的獼猴后代父親或母親的概率。本研究應(yīng)用14個微衛(wèi)星標記CPE2和CPE1可達99.99%和99.87%，僅使用4個多態(tài)性最為豐富的位點CPE2就可以達到99%，而使用7個多態(tài)性最為豐富的位點，CPE1也可以達到99%，這顯示了所篩選出的位點應(yīng)用于獼猴親子鑒定的可靠和高效性。

在本次實驗中有4個位點偏離Hardy-Weinberg平衡，5個位點的無效等位基因頻率(F(Null))和群體內(nèi)近交系數(shù)(FIS)同時為正值，出現(xiàn)這樣的結(jié)果一方面可能是實驗樣本是混合樣本(部分獼猴為本所原有而另一部分則于另一猴場引進)，不同地方群體會造成Wahlund效應(yīng)，另一方面，人工飼養(yǎng)獼猴群不是隨機交配，因此會使間接估算法(假定群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài))高估無效等位基因頻率[15]，而無效等位基因的存在會使群體間的遺傳分化和遺傳距離增大[16～17]，顯著增加群體的近交率。雖然目前的結(jié)果并不能說明本所的獼猴群存在近交現(xiàn)象，但是人工飼養(yǎng)群的數(shù)量有限，如果進行長期繁育，應(yīng)用微衛(wèi)星分子標記對種群中的個體進行親子鑒定建立可靠的遺傳譜系，從而進行精細的繁育編配以避免近親交配就顯得尤為重要。

綜上所述, 這14個多態(tài)性微衛(wèi)星位點能夠?qū)ΛJ猴(川西亞種)進行特異的個體鑒別、有效的親子鑒定和準確的群體遺傳學(xué)參數(shù)計算, 是獼猴可靠、高效的分子標記, 可以應(yīng)用于獼猴人工飼養(yǎng)種群的遺傳學(xué)管理。

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Genetic Analysis of Rhesus Macaques(Macaca mulatta)Using Microsatellite Markers

YANG Na , LIU Xiao-shuai, ZHOU Liang, ZENG Dai-wen
(Institute of Laboratory Animals of Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 601212, China)

ObjectiveInbreeding is the big problem in captive colonies of rhesus macaques.To preserve genetic variability, the exact pedigree must established by genetic markers.MethodsFourteen autosomal short tandem repeat (STR) loci with high information content were used to 64 rhesus macaques by fluorescently-labeled primer polymerae chain reaction (PCR) and capillary electrophoresis typing.Then, these loci were evaluated by unique genetic characterization, parentage determination, and estimation of parameters.ResultsSeven of the 14 markers have high gene diversity (He) and polymorphic information content (PIC)(＞0.8), the combined probability of genetic identity (CPI) at all loci is 1.21E-18,and the combined probability of no-parent exclusion (CPE1) or single parent exclusion (CPE2) at all loci can reach 0.9985 and 0.9999 respectively.ConclusionThese markers are reliable and highly informative genetic markers, can provide for powerful parentage determination, unique genetic characterization,and accurate estimation of parameters, which are all useful for genetic management of rhesus macaques.

Rhesus macaques; STR; Genetic management

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0131-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.010

2013-09-06

四川省科技基礎(chǔ)條件平臺項目(2060503)

楊 娜(1982 -), 女, 碩士, 助理研究員, 研究方向:實驗動物遺傳控制,

E-mail: jasmineyang111@gmail.com

曾代文, E-mail: zdw.11@163.com