血脂對(duì)大鼠離體動(dòng)脈環(huán)張力的影響

張 怡, 詹維偉, 吳永杰, 周吳剛, 陳棟睿, 蔣為民, 鄭 琳

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院1. 附屬瑞金醫(yī)院超聲科, 上海 200025;

2. 附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所, 上海 200025; 3. 病理學(xué)教研室, 上海 200025)

血脂對(duì)大鼠離體動(dòng)脈環(huán)張力的影響

張 怡1, 詹維偉1, 吳永杰2, 周吳剛2, 陳棟睿2, 蔣為民3, 鄭 琳3

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院1. 附屬瑞金醫(yī)院超聲科, 上海 200025;

2. 附屬瑞金醫(yī)院高血壓研究所, 上海 200025; 3. 病理學(xué)教研室, 上海 200025)

目的 觀察高脂血癥大鼠及動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)張力的變化, 方法 SD大鼠隨機(jī)分為4組(T1組，n=10，高膽固醇喂養(yǎng)4周; T2組, n=10，高膽固醇喂養(yǎng)12周; C1組，n=10，正常飲食4周; C2組，n=10，正常飲食12周)，各組動(dòng)物均測(cè)定血清血脂濃度及腹主動(dòng)脈環(huán)對(duì)苯腎上腺素, 高鉀溶液及乙酰膽堿的反應(yīng), 并均行病理切片, 再光鏡檢查以評(píng)估主動(dòng)脈粥樣硬化的程度。結(jié)果 T1組的最大收縮張力值及最大舒張百分比顯著低于C1組(P＜0.01; P=0.001)。T2組的最大收縮張力值顯著高于C2組(P＜0.05)，最大舒張百分比顯著低于C2組(P＜0.001)。T2組的最大收縮張力值顯著高于T1(P＜0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示: 最大收縮張力值與甘油三酯呈顯著正相關(guān)(r=0.435, P＜0.05)。最大舒張百分比與收縮壓、總膽固醇及低密度脂蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318,P=0.046; r=-0.449, P=0.004; r=-0.411, P=0.008), 與高密度脂蛋白呈顯著正相關(guān)(r=0.324,P=0.041)。結(jié)論 高脂飲食使大鼠主動(dòng)脈早期收縮與舒張能力均降低，動(dòng)脈環(huán)最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小。

高脂血癥; 動(dòng)脈環(huán)張力; 動(dòng)脈粥樣硬化; SD大鼠

動(dòng)脈環(huán)張力主要反映動(dòng)脈舒張功能的狀態(tài)及彈性功能, 在一定程度上能反映動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能[1],內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害往往是心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的誘發(fā)因素之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠高脂血癥模型和動(dòng)脈粥樣硬化模型，應(yīng)用離體動(dòng)脈環(huán)張力測(cè)定的方法，探討血脂對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)張力的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及模型制備

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只, 體質(zhì)量230～270 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2007-0005]。隨機(jī)分為4組: 高脂飲食4周組(T1組)10只, 飼料中含1.3%膽固醇、16.4%豬油、0.3%膽鹽、10%蔗糖、8.5%酪蛋白、1.6%預(yù)混料、1.9%麥芽糊精、60%繁殖鼠料喂養(yǎng), 誘發(fā)高脂血癥模型; 對(duì)照組(C1組)10只, 用普通飼料喂養(yǎng)4周; 高脂飲食12周組(T2組)10只, 飼料成分同T1組, 誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化模型; 對(duì)照組(C2組)10只, 用普通飼料喂養(yǎng)12周。4組大鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SYXK(滬)2008-0051]。

1.2 血生化檢查

實(shí)驗(yàn)前分別對(duì)4組大鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，并采用日本SOFTRON公司BP-98A型智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)通過(guò)尾套法測(cè)量大鼠的基礎(chǔ)血壓(收縮壓Ps及舒張壓Pd)，記錄數(shù)值(圖1)。

在空腹?fàn)顟B(tài)下，經(jīng)心臟采血4 ml，檢測(cè)4組大鼠的血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)。于4周后獲取T1組及C1組的血生化指標(biāo);12周后獲取T2組及C2組的血生化指標(biāo)。

1.3 儀器和方法

實(shí)驗(yàn)4周后, 根據(jù)1 ml/300g的劑量于T1及C1組大鼠的腹腔內(nèi)注射水合氯醛適量(實(shí)驗(yàn)12周后，T2及C2組大鼠重復(fù)以下步驟)，在麻醉狀態(tài)下切開(kāi)大鼠胸腹腔，分離出腹主動(dòng)脈，放入預(yù)冷的改良 Kreb’s液中(NaCl 118 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L, NaHCO325 mmol/L，Glu 11.1mmol/L,10% NaOH滴定至pH 7.4)，仔細(xì)剔除血管周圍脂肪和結(jié)締組織，剪成2～3 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，殘余腹主動(dòng)脈段待送病理。將主動(dòng)脈環(huán)置于DMT 610M multi-wire myograph system四通道微血管張力測(cè)定系統(tǒng)(丹麥)的每個(gè)獨(dú)立單元，即一個(gè)5 ml不銹鋼浴槽中，用專用針式固定架將血管固定在浴槽中。槽內(nèi)改良Kreb’s液，通以O(shè)2-C02混合氣(體積分?jǐn)?shù)分別為0.95和0.05)，溫度維持在37℃。固定架的一端與張力傳感器相連，另一端與微固定器相連，使用血管正?；绦虼_定血管被動(dòng)的長(zhǎng)度-張力關(guān)系，記錄血管張力。

圖 1 大鼠血壓的標(biāo)準(zhǔn)曲線

調(diào)節(jié)靜息張力2 g，平衡60 min。平衡結(jié)束后，用60 mmol/L高鉀Kreb’s溶液預(yù)刺激血管2次，每次15 min，期間用Kreb’s液洗脫，記錄第二次刺激的最大收縮張力值。用Kreb’s液洗脫之后，給予1 μmol/L苯腎上腺素(Phenylephrine, Phe)，至最大收縮張力后，記錄下苯腎上腺素最大收縮張力值; 再給予1 μmol/L乙酰膽堿(Ach)，至最大舒張?zhí)?，記錄每一?dòng)脈環(huán)的最大收縮(或舒張)張力值。以Phe或高K溶液誘發(fā)最大收縮幅度為100%，加入Ach后的血管張力幅度與誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化(圖2)。最大舒張百分比=(苯腎上腺素最大收縮張力值-乙酰膽堿最大舒張張力值)/苯腎上腺素最大收縮張力值×100%。

1.4 病理學(xué)檢查

4組大鼠均取殘余腹主動(dòng)脈，每段約5 mm，沿動(dòng)脈長(zhǎng)軸縱行剖開(kāi)，用冰鹽水沖洗后，貯存于4%中性甲醛溶液中固定24 h以上，待常規(guī)脫水、浸蠟，包埋成蠟塊，行HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較運(yùn)用單因素ANOVA 法；2組間比較運(yùn)用非配對(duì)t檢驗(yàn)法; 兩變量相關(guān)分析運(yùn)用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn); 簡(jiǎn)單線性回歸分析運(yùn)用Stepwise模型選擇法多元逐步線性回歸模型進(jìn)行。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 2 大鼠主動(dòng)脈環(huán)的收縮舒張反應(yīng)曲線

表 1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

表 2 大鼠動(dòng)脈環(huán)張力參數(shù)的比較

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)的比較

4組大鼠間基礎(chǔ)值比較, TC、TG、HDL、LDL、體質(zhì)量、身長(zhǎng)、收縮壓及舒張壓的差異均無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)后比較, T1組大鼠的TC及LDL明顯高于對(duì)照組C1(P＜0.001; P=0.001), T2組大鼠的收縮壓、TC、TG、LDL及HDL均明顯高于C2組(P均＜0.05), T2組的收縮壓、舒張壓及TG明顯高于T1組(P均＜0.05)(表1)。對(duì)照C1組與C2組間大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 血管環(huán)肌張力參數(shù)的比較

T1組的高鉀溶液最大收縮張力值、苯腎上腺素最大收縮張力值及最大舒張百分比顯著低于C1組(P＜0.001; P＜0.01; P=0.001)。T2組的高鉀溶液最大收縮張力值及苯腎上腺素最大收縮張力值顯著高于C2組(P＜0.05; P＜0.05)，最大舒張百分比顯著低于C2組(P＜0.001)。而T2組與T1組比較，高鉀溶液最大收縮張力值及苯腎上腺素最大收縮張力值顯著高于T1(P＜0.001; P＜0.05)，最大舒張百分比在兩組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

2.3 相關(guān)性分析

苯腎上腺素最大收縮張力值與高鉀溶液最大收縮張力值、甘油三酯呈顯著正相關(guān)(r=0.707, P＜0.001;r=0.435, P＜0.05)(表3)。最大舒張百分比和收縮壓、TC及LDL呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.318, P=0.046;r=-0.449, P=0.004; r=-0.411, P=0.008), 和HDL呈顯著正相關(guān)(r=0.324, P=0.041)(表4)。

2.4 簡(jiǎn)單線性回歸分析

TC是最大舒張百分比的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(β=0.381,P=0.010)。

2.5 病理學(xué)觀察

光鏡顯示: C1、C2組大鼠的腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)光整，內(nèi)皮細(xì)胞下連接緊密、間隙窄，內(nèi)膜平坦。中膜彈力纖維結(jié)構(gòu)清晰，呈波浪狀排列。外膜較薄，為疏松結(jié)締組織(圖3A); T1組大鼠腹主動(dòng)脈壁層次尚清晰，內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，內(nèi)皮下可見(jiàn)少量泡沫細(xì)胞堆積(圖3B); 而T2組大鼠的腹主動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜明顯增厚，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，斑塊表面為纖維帽，其下有脂質(zhì)沉積，深部為壞死物質(zhì)，中膜明顯受壓萎縮，呈較成熟的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(圖3C)。

表 3 Phe最大收縮張力值的相關(guān)性分析

表 4 最大舒張百分比的相關(guān)性分析

圖 3 大鼠腹主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，其本質(zhì)是動(dòng)脈壁對(duì)從血漿侵人脂質(zhì)的反應(yīng)，長(zhǎng)期高脂膳食可導(dǎo)致血脂濃度異常升高。本組資料中，大鼠經(jīng)4周高脂膳食后，血清TC及LDL明顯增高，提示高脂血癥模型成功建立，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]。12周后，血清TC、TG、LDL、HDL均較對(duì)照組顯著升高，病理提示腹主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣斑塊形成，提示動(dòng)脈粥樣硬化模型成功建立。其中，LDL值與高脂飲食4周后比較雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但LDL值確有隨病程延長(zhǎng)而增高的趨勢(shì)。也符合文獻(xiàn)報(bào)道的“LDL與動(dòng)脈粥樣硬化呈顯著正相關(guān)”[3]。

關(guān)于采用體外離體動(dòng)脈環(huán)張力實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試血脂水平對(duì)動(dòng)脈環(huán)收縮和舒張功能的影響, 國(guó)內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道。由于高鉀溶液及苯腎上腺素都能誘導(dǎo)血管收縮, 只是機(jī)制不同[4～5]。而乙酰膽堿為內(nèi)皮依賴和受體依賴性舒張血管物質(zhì), 內(nèi)皮源性NO介導(dǎo)其舒張血管作用, 可以反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能變化[6], 故本實(shí)驗(yàn)參照Mulvany等[7]描述的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 最終發(fā)現(xiàn)T1組大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)的收縮能力和舒張能力較正常對(duì)照組均下降, 這與蔡波等[2]的研究結(jié)果相符。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞下有少量泡沫細(xì)胞堆積，提示早期動(dòng)脈硬化。進(jìn)一步證明了高脂飲食使大鼠主動(dòng)脈早期收縮與舒張能力均降低的機(jī)制，可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及血管舒張功能的異常與內(nèi)皮釋放血管舒張因子(EDRF/NO)障礙有關(guān)[8～9]。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)脈粥樣硬化模型組的腹主動(dòng)脈環(huán)的最大收縮張力值明顯大于對(duì)照組及高脂模型組，推測(cè)可能是動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)，由于內(nèi)皮的嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致血管內(nèi)皮釋放ET增加，因此使主動(dòng)脈對(duì)高鉀溶液及苯腎上腺素的收縮反應(yīng)增強(qiáng)，引起血管張力紊亂。然而，T2組的最大舒張百分比顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明動(dòng)脈硬化程度越嚴(yán)重，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度越嚴(yán)重，動(dòng)脈環(huán)的張力越紊亂，動(dòng)脈環(huán)的舒張能力越差。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T2組與T1組在最大舒張百分比的比較時(shí)，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能是本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型建立的時(shí)間較短，其斑塊雖已形成，但對(duì)動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響可能與人類動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)對(duì)血管的影響不完全一致。臨床慢性硬化病變時(shí)間較長(zhǎng)，可能已有膠原纖維的增多，彈性纖維減少甚至消失，中膜平滑肌萎縮，對(duì)動(dòng)脈僵硬度影響較大。

此外，相關(guān)分析結(jié)果表明，最大舒張百分比和收縮壓、TC及LDL呈顯著負(fù)相關(guān), 和HDL呈顯著正相關(guān)。因此，動(dòng)脈環(huán)最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小，血脂的水平對(duì)動(dòng)脈環(huán)張力的影響是顯而易見(jiàn)的。即在動(dòng)脈粥樣斑塊還沒(méi)形成之前，血脂水平的高低對(duì)動(dòng)脈環(huán)的張力就產(chǎn)生了影響，使動(dòng)脈收縮和舒張功能均降低。當(dāng)有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊出現(xiàn)時(shí)，動(dòng)脈環(huán)的張力發(fā)生了明顯變化，內(nèi)皮功能的損害為最大舒張百分比的顯著減小提供了有力的病理學(xué)診斷基礎(chǔ)，表明內(nèi)皮依賴性舒張功能降低出現(xiàn)于斑塊形成之前，符合先功能，后形態(tài)的病變過(guò)程。

本研究表明，高脂飲食使大鼠腹主動(dòng)脈早期收縮與舒張能力均降低，致動(dòng)脈硬化期動(dòng)脈的收縮功能反而增高；腹主動(dòng)脈環(huán)的最大舒張百分比隨著總膽固醇及低密度脂蛋白水平的增高而減小，并隨著高密度脂蛋白水平的減低而減小。

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Effects of High Fat Diet on Arterial Ring’s Tension in SD Rats

ZHANG Yi1, ZHAN Wei-wei1, WU Yong-ji2, ZHOU Wu-gang2, CHEN Dong-rui2, JIANG Wei-min3, ZHENG Lin3
(1. Department of Ultrasound, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China; 2. Shanghai Institute of Hypertention,Shanghai 200025, China; 3. Department of Pathology,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo observe the changes of arterial ring’s tension in SD rats with hypercholesterolemia and atherosclerosis.MethodsIn vitro isometric tention experiment was used to measure arterial ring’s maximum contractile tension, arterial ring’maximum relaxation pencentage of the aorta in cholesterol-fed SD Rats (group T1, n=10, for 4 weeks; group T2, n=10, for 12 weeks) and normal control rats(group C1, n=10; group C2, n =10). All parameters and blood biochemical markers(total cholesterol, triglycerides, low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol)among groups were analyzed with ANOVE factor analysis.Correlation was analyzed with Pearson analysis.Light microscopic evaluation was used to demonstrate atherosclerotic changes in the aorta.ResultThe maximum contractile tension value to KCl and phenephrine and the maximum relaxation pencentage of the aorta in group T1 were significantly lower than those of group C1 controls (P＜0.05). The maximum relaxation pencentage of the aorta in group T2 rats were significantly lower than those of group C2 controls (P＜0.05). The maximum contractile tension value to KCl and phenephrine in group T2 were significantly higher than those of group T1(P=0.001, P＜0.05). However, no significances were found with the maximum relaxation percentage in group T1 and T2 (P＞0.05). Correlation analysis shows: the maximum contractile tension value of the aorta was positively correlated with triglycerides (r=0.435,P＜0.05). The maximum relaxation pencentage of the aorta was negatively correlated with systolic pressure,total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (r=-0.318, P=0.046, r=-0.449, P=0.004;r=-0.411, P=0.008), also it was negatively correlated with high-density lipoprotein cholesterol(r=0.324,P=0.041). Light microscopy confirmed morphologic typical changes of aortic atherosclerosis in group T1 and T2. Conclution High fat diet will lower the ability of rats’s arterial contraction and relaxation in earlier state. The maximum relaxation percentage was much lower associated with the increasement of total cholesterol and low density lipoprotein.

Hypercholesterolemia; Arterial ring’s tension; Atherosclerosis; SD rats

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0126-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.009

2013-09-09

張 怡(1976-), 女, 碩士, 主治醫(yī)師, 從事超聲診斷工作; E-mail: cheri_zhangsh@hotmail.com

詹維偉, 男, 主任醫(yī)師, 碩士研究生導(dǎo)師,E-mail: shanghairuijin@126.com