ZDF(fa/fa)大鼠的糖脂代謝特點與胰島素抵抗特性

奚賽飛, 斯徐偉, 朱科燕, 陳小真, 楊濤濤, 陳民利

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心, 杭州 310053; 2. 紹興市人民醫(yī)院, 紹興312000)

ZDF(fa/fa)大鼠的糖脂代謝特點與胰島素抵抗特性

奚賽飛1, 斯徐偉2, 朱科燕1, 陳小真1, 楊濤濤1, 陳民利1

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心, 杭州 310053; 2. 紹興市人民醫(yī)院, 紹興312000)

目的 觀察ZDF(fa/fa)大鼠高脂飼喂后的糖脂代謝特點和胰島素抵抗特性。方法 取ZDF(fa/fa)大鼠6只(ZDF模型組), 每日飼喂高脂飼料, 另取ZDF(fa/+)大鼠6只(ZDF對照組), 飼喂普通飼料, 連續(xù)飼喂6周; 每周稱重, 隔周檢測GLU、TG、CHOL、TC、HDL-C、LDL-C, 計算TC/HDL-C和AI，于第6周檢測空腹胰島素，并進(jìn)行糖耐量與胰島素耐量試驗，計算HOMA-IR和HOMA-β。結(jié)果 ZDF(fa/fa)大鼠高脂飼喂后空腹血糖、血脂水平迅速升高(P＜0.01)，TC/HDL-C和AI顯著升高(P＜0.01)，飼喂第4周后趨于穩(wěn)定; 第6周的空腹胰島素和HOMA-IR顯著升高(P＜0.01)，而HOMA-β則顯著降低(P＜0.01)。結(jié)論 ZDF(fa/fa)大鼠飼喂高脂飼料后出現(xiàn)高血糖伴高脂血癥、糖耐量異常和高胰島素血癥，同時出現(xiàn)胰島素耐量增加和胰島素敏感性降低，較適合于胰島素抵抗引起的2型糖尿病和代謝綜合癥的研究。

ZDF大鼠; 糖脂代謝; 胰島素抵抗

糖尿病(diabetes mellitus, DM)已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，其中，2型糖尿病(T2DM)是發(fā)病的主體，約占 90%[1]。ZDF(Zucker Diabetic Fatty rat) 大鼠是自發(fā)性的糖尿病模型，是由高血糖的Zucker(fa/fa) 大鼠近交繁殖得到的亞系, 與Zucker(fa/fa)大鼠相比，ZDF(fa/fa)大鼠肥胖較輕但胰島素抵抗更嚴(yán)重，但該大鼠須經(jīng)特殊飼料誘導(dǎo)后才出現(xiàn)高脂血癥和高血糖癥[2], 國外采用特制的高脂飼料purina#5008[3]。最近北京維通利華有限公司從Charles River引進(jìn)了ZDF大鼠，使用國內(nèi)普通的高脂飼料配方是否能產(chǎn)生同樣的誘導(dǎo)效應(yīng)，或其胰島素抵抗的特征表現(xiàn)如何。為此，本實驗采用國內(nèi)常用的高脂飼料飼喂ZDF(fa/fa)大鼠，觀察其糖脂代謝特點和胰島素抵抗特性, 為ZDF(fa/fa)大鼠在糖尿病和代謝綜合癥等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6～7周齡雄性ZDF(fa/fa)大鼠6只、雄性ZDF(fa/+)大鼠6只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]; 飼養(yǎng)于屏障實驗室[SYXK(浙)2008-0115], 環(huán)境溫度20±2℃，相對濕度50%～60%，光照: 12 h/12 h明暗交替，噪音＜50 dB; 每籠IVC籠內(nèi)飼養(yǎng)2只大鼠，自由飲食，并在試驗過程中按實驗動物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

血糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等試劑盒，批號分別為25050/952012/1、16882/00000020、13052/931013/1、57158/975013/1，購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司; 低密度脂蛋白(LDL-C)，批號: D1208051，購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司; 大鼠胰島素(INS)ELISA檢測試劑盒，批號: E2013100801，購自杭州誠維科技生物有限公司; 7020型全自動生化分析儀(日本日立公司); Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、Advantage血糖儀(德國羅氏公司)。

1.3 高脂飼料配方

參考國內(nèi)常用的高脂飼料配方[4]: 10%蔗糖，0.5%膽固醇，10%油，5%蛋黃粉，0.25%3號膽鹽，74.25%基礎(chǔ)飼料。

1.4 實驗方法

ZDF大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3 d后，稱體質(zhì)量，尾靜脈取血進(jìn)行血糖血脂檢測，ZDF(fa/fa)大鼠6只(ZDF模型組), 每日飼喂高脂飼料, 另ZDF(fa/+)大鼠6只(ZDF對照組), 每日飼喂普通飼料, 連續(xù)飼喂6周。每周稱體質(zhì)量, 隔周檢測血糖血脂, 第6周進(jìn)行空腹胰島素檢測、糖耐量與胰島素耐量試驗。

1.4.1 血糖血脂檢測 各組動物禁食12 h后，分別在實驗前（0周）、實驗后2、4、6周時尾靜脈取血1 ml，3 000 r/min離心10 min, 分離血清，用全自動生化分析儀檢測GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)，并計算心血管危險因子TC/HDL-C和動脈粥樣硬化指數(shù)AI=（TC-HDL-C）/HDL-C。

1.4.2 糖耐量試驗和INS檢測 試驗第6周時，各組大鼠禁食不禁水16 h后, 灌胃給予2.5 g/kg的葡萄糖溶液, 采用羅氏血糖儀測定給糖前(0 min)、糖負(fù)荷后30 min、60 min、120 min、180 min時的血糖濃度。計算180 min糖耐量曲線下面積, 公式為: 糖耐量曲線下面積AUC= (a+b)*1/4+(b+c)*1/4+(c+d)*1/2+(d+e)*1/2(a、b、c、d、e分別代表給糖前及給糖后30 min、60 min、120 min、180 min的血糖水平)。并在檢測血糖時，同時用酶標(biāo)儀檢測血清INS含量，利用穩(wěn)態(tài)模型評價(HOMA)指數(shù)中的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)，評價動物胰島素抵抗情況。計算公式為HOMA-IR = FBG(空腹血糖)×FINS(空腹胰島素)/22.5，HOMA-β=20 × FINS/(FBG-3.5)。1.4.3 胰島素耐量試驗 各組大鼠禁食不禁水16 h后，皮下注射0.5 U/kg胰島素，采用羅氏血糖儀測定注射胰島素前(0 min)、注射胰島素后30 min、60 min、120 min、180 min時的血糖。

注: 與ZDF對照組比, **P＜0.01。A: 體質(zhì)量, B: 空腹血糖圖 1 ZDF大鼠體質(zhì)量和空腹血糖Note: compared with the control group, **P＜0.01. A: weight, B: fasting blood glucoseFigure 1 Body weight and FBG in ZDF rats

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量和空腹血糖的變化

ZDF模型組體質(zhì)量明顯高于ZDF對照組(P＜0.01),試驗期間，ZDF對照組體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定增長，而ZDF模型組體質(zhì)量在高脂飼喂后第1～2周快速增長，在飼喂第2周之后體質(zhì)量增加趨于緩慢。同時可見，ZDF對照組空腹血糖水平一直處于穩(wěn)定狀態(tài)，而ZDF模型組在高脂飼喂后空腹血糖迅速顯著上升(P＜0.01)，在飼喂第2周之后ZDF模型組逐漸趨于穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)(圖1)。

2.2 大鼠血脂和TC/HDL-C、AI的變化

與ZDF對照組比, 高脂飼喂后, ZDF模型組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平均迅速顯著升高(P＜0.01), 高脂飼喂2周之后即第4、6周時TG水平逐漸趨于穩(wěn)定, 而TC、HDL-C和LDL-C水平仍持續(xù)上升, 尤其是LDL-C水平呈現(xiàn)倍數(shù)增高。另外,ZDF模型組高脂飼喂后心血管危險因子TC/HDL-C和動脈硬化指數(shù)AI亦顯著升高(P＜0.01)(圖2和表1)。

2.3 大鼠糖耐量試驗

糖耐量試驗發(fā)現(xiàn)，ZDF對照組經(jīng)口灌胃給予2.5 g/kg的葡萄糖后，ZDF(fa/+)大鼠血糖值上升緩慢，60 min達(dá)到高峰后迅速下降，180 min的血糖值降至給糖前(0 min)水平; 而ZDF模型組經(jīng)口灌胃給予2.5 g/kg的葡萄糖后，ZDF(fa/fa)大鼠血糖值快速上升，60 min達(dá)到高峰，之后血糖下降緩慢，180 min的血糖值仍顯著高于給糖前(0 min)水平(P＜0.01), 與ZDF對照組比，ZDF模型組180 min糖耐量曲線下面積顯著升高(P＜0.01)(表2)。

2.4 大鼠胰島素耐量試驗

注: 與ZDF對照組比, **P＜0.01; A: CHOL, B: TG, C: HDL-C, D: LDL-C圖 2 實驗期間ZDF大鼠血脂水平Note: compared with the control group, **P＜0.01. A: CHOL, B: TG, C: HDL-C, D: LDL-CFigure 2 Lipid levels in ZDF rats during experiment

胰島素耐量試驗發(fā)現(xiàn)，ZDF對照組皮下注射胰島素后血糖迅速下降，在注射胰島素后30 min時血糖值下降顯著(P＜0.01)，在達(dá)到低值(60 min)后上升緩慢，120 min時維持在較低水平，180 min時仍顯著低于注射胰島素前(0 min)的水平(P＜0.01);而ZDF模型組皮下注射胰島素后血糖下降緩慢, 在注射胰島素后30 min時血糖下降仍不明顯(P＞0.05),達(dá)到低值(60 min)后迅速上升, 180 min的血糖值高于注射胰島素前(0 min)的水平(表3)。

2.5 大鼠空腹胰島素水平和胰島素抵抗程度

與ZDF對照組比，ZDF模型組高脂飼喂后空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)顯著升高(P＜0.01)，而HOMA-β 指數(shù)則顯著降低(P＜0.01)(表4)。

表 1 實驗期間ZDF大鼠TC/HDL-C和AITable 1 TC/HDL-C and AI in ZDF rats during the experiment

表 2 ZDF大鼠糖耐量試驗Table 2 Results of OGTT in ZDF rats

表 3 ZDF大鼠胰島素耐量試驗Table 3 Results of ITT in ZDF rats mmol/L

表 4 ZDF大鼠空腹胰島素和HOMA指數(shù)Table 4 Results of FINS and HOMA index in ZDF rats

3 討論

目前, 全世界糖尿病的患病人數(shù)已超過2.85億,到2030年預(yù)計將近5億。在我國20歲以上人群中糖尿病的患病率高達(dá)9.7%, 約有9 240萬成年人在受糖尿病折磨[5]。在DM中，2型糖尿病是發(fā)病的主體，約占90%[1]。理想的動物模型是研究2型糖尿病的關(guān)鍵。許多研究發(fā)現(xiàn)普通大鼠長期高脂飼喂，可出現(xiàn)胰島素抵抗的特征，但是血糖升高不明顯[6～7]。最近國內(nèi)引進(jìn)了具有自發(fā)性2型糖尿病的ZDF(Zucker Diabetic Fatty rat) 大鼠, 但該大鼠須經(jīng)特殊飼料purina#5008誘導(dǎo)后, 才能產(chǎn)生高脂血癥和高血糖癥, 14周齡時則出現(xiàn)胰島素缺乏[2]。由于進(jìn)口飼料價格昂貴, 在應(yīng)用上受到限制。為此, 本實驗采用國內(nèi)普通的高脂飼料配方進(jìn)行飼喂試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用國內(nèi)常用的高脂飼料配方飼喂后,ZDF(fa/fa)大鼠血糖迅速升高, 在高脂飼喂2周時即可出現(xiàn)高血糖癥, 血糖平均值在25 mmol/L左右, 之后處于穩(wěn)定的高血糖狀態(tài), 并伴有高血脂、高胰島素血癥和糖耐量異常等代謝綜合癥, 這與國外報道的資料相一致[3]。由于大鼠容易受抓取、固定等實驗操作的影響引起應(yīng)激導(dǎo)致高血糖, 而ZDF(fa/+)大鼠無自發(fā)性高血糖。因此, 本實驗用ZDF(fa/+)大鼠作為對照, 試驗期間ZDF(fa/+)大鼠的血糖值均處于穩(wěn)定狀態(tài), 說明本實驗操作中無應(yīng)激反應(yīng), 可排除ZDF(fa/fa)大鼠因?qū)嶒灢僮鞫鸬膽?yīng)激性血糖升高。

2型糖尿病血脂異常的發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗密切相關(guān), 2型糖尿病患者經(jīng)常伴有脂代謝紊亂, 導(dǎo)致血脂升高，血脂升高又可以吸附大量的胰島素，導(dǎo)致患者胰島素抵抗，從而形成惡性循環(huán)[8～9]。實驗性的2型糖尿病大鼠模型常用SD大鼠或Wistar大鼠高脂飼喂或小劑量注射STZ聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)，但大鼠對脂質(zhì)的吸收率低，清除快，造模后的TC值大多在2.5 mmol/L左右[4,10～11]，而人類正常的TC值范圍為3.1～5.18 mmol/L，實驗性2型糖尿病大鼠模型的血脂水平與臨床差異較大。而本研究發(fā)現(xiàn)，ZDF(fa/fa)大鼠高脂飼喂2周時, 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量均顯著升高, 并明顯高于人類的正常水平, ZDF(fa/fa)大鼠血清TC值均在7.0 mmol/L以上, 并隨著飼喂周期的延長而持續(xù)升高,高脂飼喂6周后, TC值平均達(dá)13.25 mmol/L, 與人類2型糖尿病引起的血脂異常相類似。高脂血癥是糖尿病血管并發(fā)癥的重要因素。目前業(yè)已證實，血清TC和LDL-C水平升高是心腦血管動脈硬化的主要危險因素。而本研究發(fā)現(xiàn)ZDF(fa/fa)大鼠高脂飼喂2周后, 心腦血管疾病的風(fēng)險因子TC/HDL-C和AI指數(shù)呈倍數(shù)升高, 說明高脂飼喂大大增加ZDF(fa/fa)大鼠發(fā)生糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險。

為進(jìn)一步評價ZDF大鼠胰島素抵抗的程度, 作者采用Matthews等提出的穩(wěn)態(tài)模型(HOMA)來測定胰島素β分泌指數(shù), 其中胰島β細(xì)胞分泌指數(shù)還可以反映動物對胰島素的敏感性, 此法簡單實用, 是評價胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。結(jié)果顯示, ZDF(fa/fa)大鼠高脂飼喂6周后, 空腹胰胰島素和HOMA-IR指數(shù)明顯升高, 而HOMA-β指數(shù)則顯著降低, 表明高脂誘導(dǎo)ZDF(fa/fa)大鼠呈現(xiàn)出胰島素抵抗特征, 并伴有胰島β細(xì)胞的功能障礙，胰島素的敏感性下降。

綜上可知, ZDF(fa/fa)大鼠飼喂高脂飼料后出現(xiàn)高血糖伴高脂血癥、糖耐量異常和高胰島素血癥, 同時出現(xiàn)胰島素耐量增加和胰島素敏感性降低, 較適合于胰島素抵抗引起的2型糖尿病和代謝綜合癥的研究。

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The Characteristics of Glucolipid Metabolism and Insulin Resistance in ZDF(fa/fa) Rats

XI Sai-fei1, SI Xu-wei2, ZHU Ke-yan1, CHEN Xiao-zhen1, YANG Tao-tao1, CHEN Min-li1
(1. Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053; China;2. Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing 312000, China)

ObjectiveTo observe the characteristics of glucolipid metabolism and insulin resistance in ZDF rats after feeding with high fat diet.MethodsSix ZDF (fa/fa) rats in model group were fed with high fat diet, 6 ZDF (fa/+) rats in control group, fed with normal diet, lasted for 6 weeks. The body weight was measured every week. Glucose, cholesterol, triglycerides, high-density lipoprotein, low density lipoprotein were measured every two weeks, TC/HDL-C and AI were calculated. In 6thweek, the fasting insulin, OGTT and ITT were measured. HOMA-IR, HOMA-β were calculated.ResultsAfter feeding with high fat diet, the blood glucose and lipid levels in ZDF model group were rapidly increased (P＜0.01),TC/HDL-C and AI were significantly increased (P＜0.01), after 4 weeks, they remained stable.In 6thweek, fasting insulin and HOMA-IR were significantly increased (P＜0.01), but HOMA-β was significantly decreased (P＜0.01).ConclusionZDF rats induced by high fat diet, exhibits hyperglycemia with hyperlipidemia, abnormal glucose tolerance and hyperinsulinemia, and also exhibits increased insulin tolerance and decreased insulin sensitivity. ZDF rats are suitable to study tyjpe 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome which caused by insulin resistance.

ZDF rats; Glucolipid metabolism; Insulin resistance

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0102-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.005

2013-11-26

1.浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究項目(2013C37021);2. “浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目”資助

奚賽飛(1989-), 女, 碩士研究生, 研究方向: 中藥藥理與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: xisaifei1228@163.com

陳民利(1963-), 女, 碩士, 教授, 研究方向: 實驗動物與比較醫(yī)學(xué), E-mail: cmli991@aliyun.com