人源性前列腺癌動物模型的初步建立

張振華, 沈增麗, 侯傳玲, 宋春嬌, 孫愛靜

(1. 紹興市人民醫(yī)院&浙江大學紹興醫(yī)院病理科, 紹興 312000;2. 溫州醫(yī)學院第一臨床學院病理科, 溫州 325003)

·論 著·

人源性前列腺癌動物模型的初步建立

張振華2, 沈增麗2, 侯傳玲1, 宋春嬌1, 孫愛靜1

(1. 紹興市人民醫(yī)院&浙江大學紹興醫(yī)院病理科, 紹興 312000;2. 溫州醫(yī)學院第一臨床學院病理科, 溫州 325003)

目的 建立中國人同一起源腫瘤不同惡性潛能前列腺癌動物模型，為研究前列腺癌轉移進展機制及激素抵抗的發(fā)生機制提供理想的動物模型。方法 采用組織塊外科原位移植法將人前列腺癌組織分別移植到虛擬去勢組及去勢組雄性裸小鼠前列腺部，成瘤后進行鼠間傳代移植，選取虛擬去勢組原位移植瘤、移植淋巴結轉移瘤、去勢組第4代淋巴結轉移瘤體外培養(yǎng)建立細胞系，應用Boyden Chamber細胞運動實驗檢測細胞遷徙轉移能力，描繪細胞生長曲線分析細胞增殖及激素依賴性，裸小鼠皮下異種移植瘤模型檢測成瘤率、腫瘤濕重及浸潤范圍驗證不同代移植瘤細胞在裸小鼠異種移植的生長狀態(tài)。結果 第1代虛擬去勢組成瘤率30%，無淋巴結轉移，取移植瘤反復原位傳代移植第3代成瘤率50%，盆腔淋巴結轉移率40%。去勢組原代移植以及來自虛擬去勢組的原位移植瘤反復原位移植均未見移植瘤，源自虛擬去勢組淋巴結轉移瘤組織反復原位傳代移植至第4代，成瘤率33%，其中一只可見盆腔淋巴結轉移。三種細胞系細胞生長、遷徙以及體外裸小鼠成瘤率均有顯著差別(P＜0.05)。結論 裸小鼠前列腺癌原位移植反復傳代可增強腫瘤成瘤率、轉移力等惡性指標。以裸小鼠淋巴結轉移瘤接種去勢裸小鼠可篩選出激素非依賴性異種移植瘤及轉移瘤。

前列腺癌; 原位異種移植; 腫瘤模型; 雄激素抵抗

人類前列腺癌的發(fā)生過程非常緩慢，欲復制出與人類前列腺癌病理過程相似的動物模型比較困難[1]。研究表明，犬類是動物中唯一可能自然發(fā)生前列腺上皮內腫瘤性增生和前列腺腺癌的動物[2]，且與人類一樣具有高齡發(fā)生、易于轉移及晚期發(fā)生雄性激素抵抗等特點，被認為是前列腺癌研究的理想模型。但由于犬類實驗較難控制且癌的自發(fā)率低，實驗費用高等原因，研究受到很大的限制。隨著基因工程技術的發(fā)展，轉基因[3～5]和基因敲除動物模型[5～6]可成為研究和認識單一基因或數(shù)個基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的有效動物模型，但由于技術不成熟不能被廣泛應用。誘發(fā)性嚙齒類動物前列腺癌模型在發(fā)病部位、病理過程和組織分化特點與人類具有相似之處[7～8]，利用已經(jīng)建系的人類前列腺癌細胞株種植于免疫缺陷動物體內所建立的異種移植動物模型，雖然在研究腫瘤發(fā)生最初時間方面存在一定缺陷，但在研究前列腺癌由雄激素依賴型向抵抗型演進、轉移機制、藥物療效等方面更加有用。

常用的人前列腺癌細胞系有LNCaP、PC3、CRW-22和LuCa-23等[9]，均為來源于美國人的細胞株，從中國人前列腺癌患者新鮮標本中分離并建立具有不同惡性潛能的前列腺癌異種移植動物模型鮮見報道，這在一定程度上限制了對中國人群或亞洲人群前列腺癌的深入研究。

本課題采用本院未經(jīng)治療的前列腺癌患者新鮮手術標本, 將腫瘤直接進行雄性BALB/c裸小鼠和去勢雄性BALB/c裸小鼠的前列腺進行原位移植, 去勢組虛擬雄激素消融治療后腫瘤進展的情況, 傳代多次直至出現(xiàn)不同惡性潛能腫瘤, 對表現(xiàn)出對激素的依賴程度以及原位移植、轉移等不同惡性潛能的移植瘤建立細胞系并進行穩(wěn)定原位移植，旨在為研究前列腺癌的進展及雄激素抵抗發(fā)生提供良好動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本獲取及處理 紹興市人民醫(yī)院住院接受手術切除的前列腺癌標本，離體后新鮮狀態(tài)下放入無菌PBS中低溫保存轉移至細胞培養(yǎng)室，無菌操作取0.5 cm3大小，用于移植，剩余部分10%中性福爾馬林固定后行常規(guī)病理學檢查。

1.1.2 主要試劑和抗體 膠原酶、人工合成雄激素R1881購自Sigma公司; BD Matrigel基質膠購自上海杰海生物科技有限公司; 戊巴比妥鈉購自中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司; 免疫組化用一抗包括雄激素受體(AR)、甲基?；o酶消旋酶(P504S)、前列腺特異性抗原抗體購自福州邁新生物科技有限公司。采用全自動免疫組化儀(Leica Bond-Max)配套染色液購于Leica公司。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物及分組 SPF級4～6周齡雄性BALB/c裸小鼠, 體質量22～25 g, 購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2007-0005 ], 墊料飼料及飲水均無菌處理。在紹興市醫(yī)學研究中心動物實驗室飼養(yǎng)并進行實驗[SYXK(浙)2009-0139]。動物分為虛擬去勢組和去勢組，實驗一周前實施手術。

1.2.2 去勢/虛擬去勢手術及原位移植瘤模型的建立 體積分數(shù)1%戊巴比妥鈉(60～80 mg/kg)麻醉裸小鼠后，仰臥位消毒下腹部皮膚及生殖器，去勢手術分別在兩側陰囊前部剪開約1 cm左右橫行開口后游離睪丸摘除并縫合; 虛擬去勢術牽出睪丸附睪后復位縫合; 移植瘤建立采取下腹部正中線近生殖器處剪開一約1 cm左右的縱行開口。游離肌肉剪開腹膜，游離膀胱并將兩側脂肪組織推開，牽出部分膀胱及精囊腺充分暴露前部前列腺(左右各一葉)，中間可見管狀小溝，用眼科剪剪開3 mm左右開口后將事先準備好的組織塊嵌入，用22號針頭7-0可吸收縫線縫合固定，臟器復位后將腹膜、肌肉、皮膚逐層縫合。

1.2.3 細胞系裸小鼠背部皮下移植瘤鑒定細胞系成瘤能力 取對數(shù)期生長細胞系制成單細胞懸液(2×106/0.2 ml), 用1 ml注射器6號針頭接種于裸小鼠雙側背部皮下，每種細胞系接種20只，虛擬去勢裸小鼠和去勢裸小鼠各10只。隔日觀察并記錄腫瘤生長狀態(tài)。8周后處死裸小鼠解剖測定腫瘤濕重。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞系的建立 選取A組初代原位移植瘤灶(LA1)、A組原位移植第三代淋巴結轉移瘤灶(LAN1)、B組第4代淋巴結轉移灶(LBN1)0.5～1 cm3，無菌RPMI1640培養(yǎng)液中冰盒中保存轉移至細胞培養(yǎng)室，無菌操作臺下PBS沖洗干凈后眼科剪剪切30 min以上至乳糜狀，PBS稀釋, 800 r/min離心, 棄上清置含15%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)，貼壁后換液.每日觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞融合成片貼壁后棄培養(yǎng)液用D-hanks沖洗2次，加入0.1%胰酶(含EDTA)溶液2 ml, 輕搖培養(yǎng)瓶, 使消化液鋪滿細胞,消化2～3 min。顯微鏡下觀察至細胞變圓、融合細胞彼此分離少數(shù)細胞懸浮后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液10 ml終止消化，反復吹打使細胞分散，將細胞懸液分裝于兩個培養(yǎng)瓶中做好標記 ，37℃、5%CO2孵育箱靜置培養(yǎng)，傳代，建立上述腫瘤體外培養(yǎng)細胞系。

1.3.2 細胞計數(shù)及增殖曲線的描繪 細胞系以3×104/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每個細胞系一個培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)過夜后，用胰酶消化細胞后加培養(yǎng)液吹打混勻，取細胞懸液用0.4%臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)，每24小時計數(shù)一次每次消化計數(shù)3孔求平均值。分別以時間為橫坐標及細胞數(shù)為縱坐標描繪生長曲線。

1.3.3 TRANSWELL侵襲實驗 將凍存于-80℃的BD Matrigel放入4 ℃冰箱過夜使其變成液態(tài)。冰塊上用無血清PRMI1640將基質膠稀釋到0.5 mg/ml上室每孔60 μl放入37 ℃培養(yǎng)箱中靜置半小時。將細胞系培養(yǎng)液倒出, D-hanks液清洗兩遍后加0.1%胰酶消化2～3 min加培養(yǎng)液吹打瓶底制成單細胞懸液, 計數(shù)板細胞計數(shù)調整細胞密度為105/ml, 200 μl/孔加入上室, 上室預先用無血清培養(yǎng)基洗一次。用無菌鑷夾取插件, 下室加500 μl/孔完全培養(yǎng)基放入CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出上室, 棄去孔中培養(yǎng)液, 用PBS清洗2遍, 甲醇固定30 min, 將小室適當風干。0.1%結晶紫染色20 min, 用棉簽輕輕擦掉上層沒有遷移的細胞, 用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即5個視野觀察細胞, 記數(shù)并計算侵襲指數(shù)。

1.4 病理學檢查

1.4.1 常規(guī)標本 手術切除標本及移植瘤離體后，10%中性福爾馬林固定12～24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備4 μm連續(xù)切片，用于HE染色及免疫組化染色。

1.4.2 免疫組化染色 Leica Bond-Max全自動免疫組化儀程序設定為: 72 ℃脫蠟2次, 室溫1次, 酒精沖洗3次，緩沖液沖洗3次。修復液pH9.0ER2抗原修復液, 100 ℃抗原修復20 min, 35 ℃緩沖液沖洗3次, 室溫3 min。特異性過氧化物酶阻斷10 min，緩沖液沖洗3次。一抗室溫孵育30 min，緩沖液沖洗3次，增效液(Post primary) 8 min，緩沖液沖洗3次。二抗8 min，緩沖液沖洗2次，各2 min，去離子水1次。DAB 10 min，去離子水沖洗3次。蘇木素復染5 min，去離子水沖洗1次，緩沖液沖洗1次，去離子水沖洗1次。梯度酒精脫水、透明,中性樹膠封固，顯微鏡檢。

結果判定: AR定位于細胞核，PSA和P504S定位于細胞質，陽性細胞比率超過20%視為陽性。

1.5 統(tǒng)計分析

計量資料采用多個樣本均數(shù)方差分析，使用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，取α=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 臨床資料

77歲男性, PSA 13 ng/ml, 術前未經(jīng)過任何治療。大體觀，彌漫增大前列腺根治標本, 大小5 cm×5 cm×4 cm。鏡檢癌細胞輕度異形，排列成不規(guī)則腺管狀(圖1A, HE×200)，免疫組化示AR、P504S、PSA陽性(圖1B、C、D, ×200)組織學診斷: 彌漫浸潤性生長前列腺癌，Gleason評分3+3=6。

2.2 腫瘤原位移植瘤形成

第1代移植9周后解剖裸小鼠，10只虛擬去勢組中3只在前列腺腫瘤接種部位形成移植瘤，呈白色魚肉狀質韌，邊界尚清楚，無包膜(圖2), 成瘤率30%。無淋巴結轉移。去勢組未見移植瘤形成。取原位移植瘤傳代移植第2代成瘤率50% 無肉眼所見淋巴結轉移，第3代成瘤率50%，其中4只見淋巴結轉移，B組未見移植瘤形成。淋巴結轉移瘤接種B組裸小鼠初代(總第4代)1只可見原位移植瘤，成瘤率10%，用該移植瘤反復傳代，第2代(總第5代)、第3代(總第6代)、第4代(總第7代)原位成瘤率分別為10%、10%和30%，第4代其中一只可見盆腔淋巴結轉移(表1)。

2.3 細胞增殖及激素依賴性分析

虛擬去勢組原位移植瘤(LA1)、移植淋巴結轉移瘤(LAN1)、去勢組第4代淋巴結轉移瘤進行體外培養(yǎng)(LBN 1)。三種細胞系分別置常規(guī)培養(yǎng)液(10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液)、低濃度血清培養(yǎng)液(3% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液)及雄激素添加培養(yǎng)液(3% FBS的RPMI1640含1.0 nmol人工合成雄激素R1881)分別培養(yǎng)，顯示在常規(guī)培養(yǎng)液中與LA1相比，LAN1和LBN1細胞具有更高增殖能力，且更早進入對數(shù)生長期; 在低濃度血清培養(yǎng)液中LA1和LAN1細胞增殖能力相似, LBN1細胞具有明顯高的增殖能力; 而在雄激素添加培養(yǎng)液中三種細胞系顯示相似的細胞增殖能力, 提示LA1、LAN1、LBN1體外增殖能力不同, LA1、LAN1顯示激素依賴性生長特性而LBN1細胞獲得雄激素抵抗生長特性(圖3)。

2.4 細胞侵襲分析

Matrigel基質膠具有模仿體內細胞外基質的功能, 一定程度上反映細胞轉移侵襲能力, 侵襲實驗分析結果顯示三種細胞系的侵襲指數(shù)分別為3.658%、4.135%和 7.201%，LBN1約為LA1的兩倍。三種細胞系侵襲指數(shù)方差分析結果顯示LA1與LBN1差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.5 裸小鼠背部皮下移植瘤模型鑒定細胞系成瘤能力

LA1、LAN1和LBN1細胞系分別于裸小鼠背部皮下移植后28 d、28 d和22 d，可在移植部位觸摸到移植瘤。8周后解剖，可見腫瘤在局部皮下生長, 未見明顯浸潤, 未見肝肺轉移。組織學觀察顯示移植瘤細胞呈團片狀生長，局部可見腺管形成趨勢, 免疫組化證實AR表達陽性(圖4)。虛擬去勢裸小鼠皮下移植瘤腫瘤濕重三組間無統(tǒng)計學差異。去勢裸小鼠證實LA1、LAN1為雄激素依賴性生長,LBN1具有雄激素抵抗生長特性。LBN1細胞在去勢和虛擬去勢鼠間腫瘤濕重無統(tǒng)計學意義(表2)。

圖 2 裸小鼠原代原位移植瘤Figure 2 The primary orthotopic transplanted tumor

圖 4 LBN1細胞裸小鼠異種移植瘤A: 組織學結構(HE×200); B: AR免疫組化染色(×400)Figure 4 LBN1 subcutaneous transplanted tumorA: histological structure(HE×200); B: AR immunohistochemical staining(×400)

表 1 人源前列腺癌裸小鼠前列腺原位移植

A:常規(guī)培養(yǎng)液; B:低濃度血清培養(yǎng)液; C:和雄激素添加培養(yǎng)液圖 3 細胞增殖曲線A: common medium; B: low serum medium; C: androgen containing mediumFigure 3 The cell proliferation curve

表 2 三種細胞系在裸小鼠皮下移植瘤的形成

3 討論

腫瘤的轉移不僅與自身分泌的腫瘤因子有關，而且很大程度上取決于腫瘤胞與腫瘤微環(huán)境的相互作用來推動分離的亞群細胞轉移[10]。如腫瘤相關巨噬細胞可誘導腫瘤基質降解，增強腫瘤遷移能力及血管形成能力。組織塊移植包含了腫瘤的所有成分，更能代表腫瘤的初始情況。本實驗表明組織塊原位移植能夠穩(wěn)定傳代并發(fā)生轉移適用于研究腫瘤的進展。

激素消融治療是轉移性前列腺癌的基礎治療手段，但大部分病人激素消融后發(fā)生雄激素抵抗，腫瘤復發(fā)轉移導致病人死亡。當前對于轉移性前列腺癌缺乏有效的治療手段，間接反映了對腫瘤進展機制不了解[11]。前列腺癌轉移進展機制的研究一直受阻于臨床相關的實驗模型，當前模型主要是通過購買國外高度惡性細胞系，培養(yǎng)制成細胞懸液進行皮下移植或者腎被膜注射移植誘發(fā)腫瘤模型[12]。這并不能確切反映國人前列腺癌的發(fā)生進展過程。本課題采用國人前列腺癌組織塊原位移植方法分別移植到去勢組及虛擬去勢組裸小鼠并傳代篩選出生物學形狀不同的腫瘤細胞進行建模，目的在于探討如何能建立模擬人體內腫瘤的進展及分化的裸小鼠腫瘤模型，為研究腫瘤轉移進展及激素抵抗發(fā)生機制奠定基礎。本實驗證實組織塊原位移植能模擬腫瘤在人體內的生長情況，移植效果與文獻報道的細胞懸液原位注射以及組織塊腎被膜移植等方法對比，人前列腺癌組織塊原位移植具有較高的成瘤率，與腫瘤生長初始環(huán)境及微環(huán)境對腫瘤的生長及調控自我分化有重大影響這一理論吻合。我們嘗試了用病人組織塊制備未經(jīng)篩選的混合細胞懸液，參考李志玲等[13]前列腺癌原位模型建立方法，采用注射移植方式移植到前列腺及精囊腺部，未能取得滿意效果。精囊腺質地較脆、前列腺被膜緊張，細胞懸液易滲出流入腹腔可能造成人為性轉移。組織塊原位移植的缺點在于操作要求較高，雖然采用眼科手術器械操作，但由于裸小鼠前列腺體積較小能移植的組織塊較小，而且會損傷組織塊及宿主臟器影響實驗結果。

經(jīng)過不間斷的傳代移植, 腫瘤成瘤率以及轉移能力等惡性潛能逐漸增強, 繼而從虛擬去勢裸小鼠淋巴結轉移癌獲得激素非依賴性質并在去勢裸小鼠第4代傳代移植中出現(xiàn)淋巴結轉移。選取具有不同生物學性狀的初代虛擬去勢裸小鼠原位移植瘤、初代虛擬去勢裸小鼠淋巴結轉移瘤以及初代去勢裸小鼠淋巴結轉移瘤作為不同惡性潛能的代表建立的細胞系證實三種細胞在增殖、遷移、激素依賴等性能上存在顯著性差別。為進一步研究中國人前列腺癌的發(fā)展以及激素抵抗發(fā)生機制提供了的良好模型。

綜上所述: 采用組織塊裸小鼠前列腺原位外科移植可模擬腫瘤在人體內的生長環(huán)境建立裸小鼠前列腺癌異種原位移植模型；裸小鼠前列腺癌原位移植反復傳代可增強腫瘤成瘤率、轉移力等惡性指標；以裸小鼠淋巴結轉移瘤接種去勢裸小鼠可篩選出激素非依賴性異種移植瘤及轉移瘤。為進一步研究中國人前列腺癌的發(fā)展以及激素抵抗發(fā)生機制提供了的良好模型。

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Establishment of Different Malignant Potential Prostate Cancer Animal Model from Same Origination

ZHANG Zhen-hua2, SHEN Zeng-li2, HOU Chuan-ling1, SONG Chun-jiao1, SUN Ai-jing1
(1. Department of Pathology, Shaoxing People's Hospital & Shaoxing Hospital of Zhejiang University,Shaoxing 312000, China; 2. Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveSupplying ideal animal model for investigating the mechanism of tumor progress and hormone resistant in prostate cancer.MethodsProstate cancer tissue was obtain via prostatectomy and cut into specimens which orthotopic transplanted into castrate group and shamcastration group nude mice .T hen tumor was harvest and transplant to next generation. until emergence of lymph node metastasis in two groups.. The cell growth curve of cell lines is used to evaluate their growth condition. Boyden chamber is used to evaluate metastasis ability of cell lines. The rate of tumor formation, weight of tumor and range of tumor infiltration of three cell lines was confirmed by subcutaneous transplant.ResultThe tumorgenic in sham-castration group is 30% without lymph node metastasis in first generation, after three passages is 50%, lymph node metastasis in pelvic is 40%. In castrate group, no tumor formation and lymph node metastasis in first generation. One pelvic lymph node metastasis is find after the forth passages which tumor origin from the lymph node metastasis of shamcastration group.. There are significant differences of cell proliferation transfer ability and tumor rate in vitro and vivo between three cell lines. (p＜0.05).ConclusionIt’s feasible that applying surgical specimens of prostate cancer to establishment .nude mice orthotopic graft model. It is possible to screen heterotransplant tumors and metastasis tumors without hormone dependency by graft rat’s lymph node metastasis tumor into castrate nude mice.

Prostate cancer; Orthotopic xenotransplantation; Tumor model; Androgen resistance

Q95-33

A

1674-5817(2014)02-0083-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.02.001

2013-09-23

浙江省醫(yī)學重點學科建設計劃(GJSX-010-004); 浙江省公益性技術應用研究計劃項目(實驗動物2011C37081); 浙江省自然科學研究基金(Y13H160104)

張振華(1986-), 男, 碩士, 醫(yī)師,E-mail: zzhsg2005@163.com

孫愛靜(1963-), 女, 醫(yī)學博士, 教授, 從事實驗動物學研究和腫瘤病理學研究,E-mail: sun_aijing@hotmail.co.jp