綜合處理措施對(duì)解除青錢(qián)柳種子休眠的影響

尚旭嵐，方升佐，徐錫增

(南京林業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

綜合處理措施對(duì)解除青錢(qián)柳種子休眠的影響

尚旭嵐，方升佐，徐錫增

(南京林業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

研究了綜合處理措施對(duì)青錢(qián)柳種殼結(jié)構(gòu)和透性的影響，并對(duì)休眠解除過(guò)程的果皮浸提液進(jìn)行了生物測(cè)定。結(jié)果表明：濃硫酸處理可在一定程度上破壞青錢(qián)柳種子木質(zhì)堅(jiān)硬的種殼結(jié)構(gòu)；在酸蝕處理基礎(chǔ)上再進(jìn)行GA3浸泡和GA3拌沙層積處理，隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)，種殼表面出現(xiàn)孔洞且逐漸變大，種胚含水量和種子呼吸速率顯著提高，果皮浸提液抑制作用顯著降低，裂口萌動(dòng)種子中可能具抑制作用的物質(zhì)種類(lèi)減少。說(shuō)明綜合層積處理能有效破壞青錢(qián)柳種子堅(jiān)硬的種殼結(jié)構(gòu)，改善種皮透性，促進(jìn)果皮中抑制物質(zhì)的降解，從而加速種子休眠的解除。

青錢(qián)柳；酸蝕處理；拌沙層積處理；種殼結(jié)構(gòu)；透性；抑制物質(zhì)

青錢(qián)柳Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja，又名青錢(qián)李、搖錢(qián)樹(shù)等，系胡桃科Juglandaceae青錢(qián)柳屬植物，是我國(guó)特有的單種屬植物。青錢(qián)柳廣泛分布于江西、浙江、江蘇、安徽、福建、湖北、湖南、四川和貴州等地海拔420～2 500 m的山區(qū)、溪谷或石灰?guī)r山地[1]。青錢(qián)柳集藥用、材用和觀(guān)賞等多種價(jià)值于一身，是一種具有極高保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的珍貴樹(shù)種[1-2]。青錢(qián)柳種子具深休眠習(xí)性，在一般播種育苗條件下隔年才能萌發(fā)，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。目前對(duì)其休眠原因已有了較深入的研究[3-6]，也有學(xué)者對(duì)解除其休眠的措施進(jìn)行了探索，結(jié)果表明酸蝕后再進(jìn)行GA3浸泡和GA3拌沙層積的綜合處理措施能有效解除青錢(qián)柳種子的休眠[7-8]，但對(duì)其作用機(jī)理還不完全清楚。本文中通過(guò)研究酸蝕后GA3浸泡和GA3拌沙層積的綜合處理措施對(duì)青錢(qián)柳種皮結(jié)構(gòu)和透性的影響，并對(duì)解除休眠的種子果皮浸提液進(jìn)行了生物測(cè)定和GC-MS鑒定，旨在探討青錢(qián)柳種子休眠解除的機(jī)制并為生產(chǎn)上采取相應(yīng)的技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試種子采自云南昆明植物園（25°10′N(xiāo)，102°44′E，海拔1 943 m）單株青錢(qián)柳（樹(shù)高，14 m；胸徑，26 cm），種子千粒重為85.25 g，飽滿(mǎn)率為41%。

酸蝕處理：種子去翅后用98%濃硫酸進(jìn)行酸蝕處理，浸泡2.5 、5.0 和7.5 h后搓去碳化層，用流水沖洗干凈，陰干待用。以未經(jīng)處理的完整干種子作為對(duì)照（干CK）。

層積處理：分自然層積處理和綜合層積處理兩種方案。自然層積處理是將青錢(qián)柳干種子清水浸種48 h后，清水拌沙后置于室外層積，種沙比約為1︰3。分別在層積1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月和4個(gè)月定時(shí)取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，以未經(jīng)處理的完整干種子作為對(duì)照（記為0）。綜合層積處理是將種子進(jìn)行酸蝕5.5 h后用500 mg·kg-1GA3浸種48 h，再用400 mg·kg-1GA3拌沙，按種沙比1︰3混勻后置于室外層積。取樣時(shí)間設(shè)置為層積2個(gè)月（記為層2月）、層積3個(gè)月（記為層3月）、種子萌動(dòng)裂口（記為裂口）、胚根剛伸出種皮（記為胚根伸出）。以未經(jīng)處理的完整干種子作為對(duì)照（干CK）。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 不同酸蝕時(shí)間種殼結(jié)構(gòu)的觀(guān)察

取2.5、5和7.5 h 3個(gè)酸蝕處理時(shí)間和干CK種子，在掃描電子顯微鏡下觀(guān)察種子表面結(jié)構(gòu)并進(jìn)行記錄和拍照。過(guò)程如下：取各處理種子10顆，在乙二胺中恒溫浸泡24 h，軟化種皮，使種子容易解剖，然后將種子置于4%戊二醛中固定，0.1 M PBS清洗，乙醇系列脫水（30%、50%、70%、90%、100%），轉(zhuǎn)入乙酸異戊酯置換，CPD-2臨界點(diǎn)干燥儀干燥、粘臺(tái)、離子濺射儀噴金，PHILIPS SEM-505掃描電子顯微鏡觀(guān)察下觀(guān)察、拍照。

1.2.2 綜合層積處理過(guò)程種殼結(jié)構(gòu)的觀(guān)察

取綜合層積處理30 、45 和60 d的種子各10顆，在掃描電子顯微鏡下觀(guān)察種子表面結(jié)構(gòu)并進(jìn)行記錄和拍照，其方法同1.2.1。

1.2.3 種胚含水量和種子呼吸速率的測(cè)定

按試驗(yàn)設(shè)計(jì)在自然層積和綜合層積各階段取樣進(jìn)行種胚含水量和種子呼吸速率的測(cè)定。呼吸速率測(cè)定采用小籃子法[9]。每個(gè)處理各取種子100粒，3次重復(fù)。含水量測(cè)定采用高溫烘干法，取樣后分離出種胚，在130℃恒溫條件下，烘至恒質(zhì)量。

式中：C為含水量（%）；M1為樣品盒和蓋的質(zhì)量(g)；M2為樣品盒和蓋及樣品的烘前質(zhì)量(g)；M3為樣品盒和蓋及樣品的烘后質(zhì)量（g）。

1.2.4 層積過(guò)程中果皮甲醇浸提液的生物測(cè)定和萌動(dòng)種子浸提液GC-MS鑒定

取綜合層積處理不同時(shí)段的果皮干粉末10 g置于100 mL錐形瓶中，加入 4倍體積80%甲醇，混勻后放入冰箱，在1～4 ℃的條件下密閉浸提。其間多次取出搖動(dòng)使其充分浸提，24 h后過(guò)濾，重復(fù)浸提2次后，混合3次所得的浸提液，減壓濃縮后定容到1 g·mL-1。參考尚旭嵐等[5]的方法對(duì)各取樣時(shí)段的果皮浸提濃縮液稀釋至0.2 g·mL-1進(jìn)行白菜種子生物測(cè)定。另將裂口種子1 g·mL-1果皮浸提液送中國(guó)林科院林產(chǎn)化工研究所儀器分析室，參考尚旭嵐等[5]的條件進(jìn)行GC-MS鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法檢驗(yàn)其差異顯著性。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸蝕時(shí)間對(duì)種殼結(jié)構(gòu)的影響

青錢(qián)柳種子經(jīng)酸蝕處理后，不僅種子變小，種殼變薄，而且其種殼表面出現(xiàn)了很多變化。不同酸蝕時(shí)間處理后種殼結(jié)構(gòu)的電鏡觀(guān)察結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的青錢(qián)柳種子種殼表面角質(zhì)化（見(jiàn)圖1A）；濃硫酸處理2.5 h后搓表面變得坑坑凹凹，出現(xiàn)少量腐蝕坑(見(jiàn)圖1B)；酸蝕5 h和7.5 h后種殼表面的腐蝕坑越來(lái)越多，且越來(lái)越大（見(jiàn)圖1C和1D）。

2.2 綜合層積處理對(duì)種殼結(jié)構(gòu)的影響

與干種子角質(zhì)化表皮結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2A）相比，綜合層積處理30 d時(shí)種殼表面出現(xiàn)了小洞（見(jiàn)圖2B），而且這些孔洞隨層積時(shí)間的延長(zhǎng)而變大（見(jiàn)圖2C和圖2D），這種特殊的結(jié)構(gòu)變化有利于種子吸水和透氣，從而加速種子休眠的解除。

2.3 不同層積處理對(duì)種子透性的影響

2.3.1 不同層積處理過(guò)程種胚含水量變化

水分是控制種子萌發(fā)的最重要因素，只有在細(xì)胞內(nèi)自由水增多的條件下，種子的貯藏物質(zhì)才能被動(dòng)員，同時(shí)使酶活化或合成而起催化作用。

圖1 不同酸蝕時(shí)間處理后種殼結(jié)構(gòu)變化Fig. 1 Changes of ultra-structure of husk scarif i ed in sulphuric acid for different times

圖2 綜合處理措施層積過(guò)程種殼結(jié)構(gòu)變化Fig. 2 Changes of husk treated by comprehensive treatments during stratif i cation

從圖3可看出，隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合層積處理的種胚含水量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，干種子種胚的含水量為4.97%，層積至剛裂口時(shí)含水量達(dá)到35.01%，比干種子增加了6倍。方差分析和多重比較結(jié)果表明，層積處理各階段種胚的含水量差異達(dá)到極顯著水平。對(duì)于自然層積種子來(lái)說(shuō)，層積第1個(gè)月種胚含水量有一個(gè)較大的提高，但隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)其種胚的含水量變化不大，到層積4個(gè)月時(shí)含水量仍只有18.94%。多重比較結(jié)果也表明，層積4個(gè)月間的種胚含水量未達(dá)到極顯著差異水平。

圖3 不同層積處理過(guò)程種胚含水量變化Fig.3 Changes of water content in embryos under different treatments

2.3.2 不同層積處理過(guò)程種子呼吸速率變化

一般干燥種子的呼吸都被抑制在最低水平上，但隨著種子的吸脹，呼吸作用會(huì)不斷增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)不同層積處理過(guò)程中呼吸速率的比較，來(lái)闡明青錢(qián)柳種子休眠解除過(guò)程的呼吸生理。

從圖4中可知，隨著綜合層積處理時(shí)間的延長(zhǎng)，青錢(qián)柳種子的呼吸速率不斷提高，層積到第3個(gè)月時(shí)提高到28.1 mg·(100 g)-1，這說(shuō)明綜合層積處理可在一定程度上改善種皮的透氣情況，至種子裂口萌動(dòng)時(shí)，其呼吸速率達(dá)到干種子的9.96倍，到胚根伸出時(shí)進(jìn)一步增加到干種子的15.21倍，達(dá)到94.17 mg·(100g)-1。方差分析和多重比較結(jié)果表明，綜合層積處理各階段的種胚呼吸速率差異達(dá)到極顯著水平。隨著自然層積時(shí)間的延長(zhǎng)，青錢(qián)柳種子的呼吸速率有所提高，但整個(gè)層積過(guò)程的呼吸速率變化都較小。方差分析和多重比較結(jié)果也表明，自然層積4個(gè)月時(shí)的呼吸速率才與干種子達(dá)到極顯著差異水平。說(shuō)明自然層積過(guò)程種子內(nèi)部的代謝活動(dòng)很微弱，這可能就是青錢(qián)柳種子在自然條件下通常需要兩冬一夏才能萌發(fā)的原因之一。

圖4 不同層積處理種子呼吸速率變化Fig. 4 Changes of respiratory rate in seeds under different treatments

2.4 果皮甲醇浸提液對(duì)白菜苗高和根長(zhǎng)的影響

綜合層積處理種子休眠解除過(guò)程的種子果皮甲醇浸提液生物測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)圖5）表明，從干種子至裂口萌發(fā)，白菜種子的苗高和根長(zhǎng)逐漸增加，說(shuō)明果皮浸提液對(duì)白菜種子的抑制作用隨著層積時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。方差分析結(jié)果表明，不同層積時(shí)間果皮浸提液對(duì)苗高和根長(zhǎng)的差異均達(dá)到極顯著水平（苗高F=41.500，P＜0.01；根長(zhǎng)F=48.683，P＜0.01）。多重比較結(jié)果顯示，干種子和水浸12 d的苗高和根長(zhǎng)與對(duì)照及其它層積時(shí)間之間均有極顯著差異，說(shuō)明干種子的抑制作用最強(qiáng)，而果皮中的抑制物質(zhì)可能隨休眠的解除而不斷降解，因此到種子裂口萌動(dòng)時(shí)抑制作用最弱。

圖5 休眠解除過(guò)程中果皮甲醇浸提液對(duì)白菜生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of extracts from pericarp during breaking dormancy on cabbage growth

2.5 裂口萌動(dòng)種子果皮甲醇浸提液GC-MS鑒定

將已裂口萌動(dòng)種子的果皮甲醇浸提液進(jìn)行GC-MS鑒定，其總離子流程見(jiàn)圖6。具有發(fā)芽抑制作用的有機(jī)化合物的種類(lèi)及相對(duì)含量列于表1。

裂口萌動(dòng)種子果皮甲醇浸提液中可能具抑制作用的有機(jī)化合物的種類(lèi)和含量較干種子果皮明顯減少[5]，而且未發(fā)現(xiàn)抑制作用較強(qiáng)的酚酸類(lèi)化合物及其衍生物，這可能正是萌動(dòng)種子果皮浸提液抑制作用降低的原因。

圖6 萌動(dòng)種子果皮甲醇浸提液GC-MS總離子流色譜Fig. 6 Total ion chromatogram of methanol extract from pericarp of germinating seeds

表1 萌動(dòng)種子果皮甲醇浸提液的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis for methanol extract from pericarp of germinating seeds

3 討 論

解除種子休眠的方法很多[10-13]，如化學(xué)藥劑處理、激素處理、層積及一些物理方法，通常需要針對(duì)種子休眠的原因來(lái)尋找適宜的破眠方法。許多林木種子休眠的原因并不是單一的，因此需要采用綜合的處理措施來(lái)解除其休眠。如深休眠的秤錘樹(shù)種子在酸蝕2 d的基礎(chǔ)上經(jīng)500 mg·kg-1GA3溶液浸種預(yù)處理可獲得40.1%的出苗率[14]。對(duì)大果冬青種子采用濃硫酸處理1.5 h后經(jīng)250 mg·kg-1GA3和0.2 % KNO3混合溶液浸種24 h，再進(jìn)行冷變溫層積的綜合處理措施可提高其發(fā)芽率[16]。王艷華等[12]研究表明，采用濃硫酸處理40 min+400 mg·kg-1GA3浸種+3～5℃低溫層積30 d的綜合處理措施可快速打破大山櫻種子的休眠。前期研究結(jié)果表明，青錢(qián)柳種子經(jīng)酸蝕后再進(jìn)行GA3浸種和GA3拌沙室外變溫層積能有效解除青錢(qián)柳種子休眠[8]，但此綜合處理措施的破眠機(jī)制尚不明晰。

董厚德等[17]對(duì)結(jié)縷草種子休眠解除前后的種皮結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的種子脂類(lèi)物質(zhì)及穎孔蓋脫落，穎孔被打開(kāi)，構(gòu)成穎的纖維網(wǎng)絡(luò)清晰可見(jiàn)，因此種子內(nèi)外的水、氣交換可順利進(jìn)行，減少胚生長(zhǎng)的阻力，發(fā)芽率達(dá)到潛在生活力水平。Lin等[18]研究結(jié)果表明，熱水浸泡等處理可促進(jìn)苦瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)其種皮表面結(jié)構(gòu)電鏡掃描觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)采用熱水浸泡等處理可使種皮細(xì)胞更大，細(xì)胞間隙也變大，透水透氣性得改善，這是種子休眠解除的原因之一。黃丹等[19]對(duì)美國(guó)桂花種子的研究結(jié)果也表明，隨著低溫濕沙層積時(shí)間的增加，美國(guó)桂花種殼中的種孔直徑有明顯增大、數(shù)量不斷增多的趨勢(shì)。陳昕等[20]對(duì)層積處理過(guò)程中黃山花楸種子表皮和子葉細(xì)胞進(jìn)行了透射電鏡觀(guān)察，結(jié)果表明黃山花楸種子萌發(fā)率和休眠解除效果與種皮角質(zhì)層破裂解體、子葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及儲(chǔ)藏物質(zhì)降解程度密切相關(guān)。本研究通過(guò)電鏡掃描觀(guān)察，結(jié)果表明酸蝕處理不僅可以有效破壞青錢(qián)柳種子表面的角質(zhì)層，而且適當(dāng)?shù)母g還可使種皮明顯變薄，這樣不僅可增加種皮的透性，又可減輕胚根突破種皮時(shí)的機(jī)械阻力。在酸蝕處理基礎(chǔ)上再進(jìn)行GA3浸種和GA3拌沙的綜合層積處理，種皮表面出現(xiàn)了明顯的小孔洞，而且這些孔洞隨層積時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。從青錢(qián)柳種子層積各階段種胚含水量和種子呼吸速率測(cè)定結(jié)果來(lái)看，自然層積處理的變化較小，而綜合層積處理的種子隨層積時(shí)間的延長(zhǎng)至種子萌動(dòng)均達(dá)到極顯著差異水平，這與其種殼表面結(jié)構(gòu)的變化是基本一致的，表明綜合層積處理措施有效促進(jìn)了種皮透性的改善。

Wróbel等[21]研究表明，休眠的葡萄種子中含有較高含量的兒茶酸和沒(méi)食子酸，以及少量的香豆酸等酚酸類(lèi)物質(zhì)，層積后這些物質(zhì)含量都大大降低。Soltani等[22]對(duì)東方山毛櫸種子進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，休眠解除過(guò)程酚類(lèi)物質(zhì)含量也呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青錢(qián)柳果皮浸提液的抑制作用隨休眠的解除而不斷減弱，與未經(jīng)處理的種子相比[5]，裂口萌動(dòng)種子果皮甲醇浸提液中可能具發(fā)芽抑制作用的有機(jī)化合物的種類(lèi)減少，這說(shuō)明綜合層積處理措施有效促進(jìn)了青錢(qián)柳種子中香草酸等酚類(lèi)物質(zhì)的降解，從而使種子休眠較快得以解除。

綜上所述，酸蝕處理可在一定程度上破壞青錢(qián)柳種子木質(zhì)堅(jiān)硬的種皮結(jié)構(gòu)，減輕其機(jī)械障礙和透性障礙。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行GA3浸種和拌沙綜合層積處理，能夠促進(jìn)種皮透性的改善和果皮中抑制物質(zhì)的降解，從而加速種子休眠的解除。因此，在生產(chǎn)上采用酸蝕處理結(jié)合GA3浸種和GA3拌沙的綜合層積處理措施是快速有效的，但值得注意的是，在進(jìn)行酸蝕處理時(shí)，應(yīng)根據(jù)種子千粒重大小以及種皮厚度確定最佳的酸蝕時(shí)間，否則容易出現(xiàn)因酸蝕時(shí)間不當(dāng)導(dǎo)致種子難萌發(fā)或種胚受傷的情況。

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Effects of comprehensive treatments on breaking dormancy of Cyclocarya paliurus seeds

SHANG Xu-lan, FANG Sheng-zuo, XU Xi-zeng
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

Cyclocarya paliurusseeds remain deep dormancy characteristics, and the seeds usually take two years to germinate in natural condition. The effects of comprehensive treatments to the structure and permeability of husk were studied, and the bioassays of the pericarp extract during breaking dormancy were measured. The results show that the chemical scarif i cation with concentrated sulphuric acid (H2SO4) could destroy the hard structure of husk to a certain extent, therefore could alleviate the mechanical and permeability barriers; after chemical scarif i cation, the seeds were soaked in gibberellic acid (GA3) and then stratif i ed in the sand moistened with GA3;while the stratif i cation time of comprehensive treatments was prolonged, some pores appeared in the surface of husk and gradually became larger; meanwhile, the water content on embryo and seed respiratory were signif i cantly enhanced, however the inhibitory effects of pericarp extract were signif i cantly reduced. The Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) identif i cation results for methanol extract from pericarp showed that there were fewer potential inhibitors in the germinating seeds than those in the untreated seeds. In conclusion, the comprehensive treatments combined with chemical scarif i cation, exogenous application of GA3and stratif i cation could destroy the hard structure of husk, promote the exchange of gas and water, and accelerate the degradation of inhibitors, therefore it could alleviate dormancy ofC. parliurusseeds in a relatively short period of time.

Cyclocarya paliurus; acid etching; mixing sand stratif i cation; seed husk structure; permeability; inhibitory substance

S718.43；Q945.35

A

1673-923X(2014)01-0042-07

2013-08-10

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣項(xiàng)目﹙［2011］18 號(hào))；國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：200904046）

尚旭嵐（1978-），女，四川樂(lè)山人，講師，主要從事森林培育研究；E-mail：shangxulan@njfu.edu.cn

方升佐（1963-），男，安徽歙縣人，教授，主要從事人工林定向培育研究；E-mail：fangsz@ njfu. edu. cn

[本文編校：謝榮秀]