雞源和鴿源基因Ⅵ型新城疫病毒對鴿的致病性比較

胡新崗+吳雙+黃銀云+郭廣富

摘要：為了比較雞源、鴿源VIb亞型新城疫病毒（NDV）對鴿的致病性差異，選取雞源毒株ZJ3和鴿源毒株 WX-10-07-Pi，分別人工感染2月齡試驗鴿。接種后，觀察試驗鴿的臨床癥狀、病理剖解變化、喉氣管和泄殖腔排毒以及組織學(xué)病變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株NDV均能導(dǎo)致接種鴿發(fā)病，發(fā)病率為100%，死亡率為0;WX-10-07-Pi感染組鴿泄殖腔排毒時間長，而且病毒檢出率比其他組高;此外，在接種組鴿的多種組織器官中均可檢測出病毒。試驗結(jié)果表明，不同基因型NDV對鴿均有致病性，但致病力強弱與 NDV毒株特性有關(guān);鴿源基因Ⅵb亞型NDV在鴿體內(nèi)可長期帶毒與排毒，且更易在鴿群中傳播。

關(guān)鍵詞：新城疫病毒;基因Ⅵ型;鴿;致病性;雞源

中圖分類號： S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0208-03

收稿日期：2014-05-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31440083）;江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012366）;江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研項目（編號：YB201006）。

作者簡介：胡新崗（1974—），男，安徽宿州人，碩士，副教授，從事動物醫(yī)學(xué)專業(yè)的教學(xué)、科研及高職教育管理研究。Tel：（0523）86158089;E-mail：gxh008@qq.com。

通信作者：吳 雙，博士，副教授，研究方向為動物傳染病防控與流行病學(xué)。E-mail：jswushuang@sina.cn。

新城疫（Newcastle disease，ND）是一種急性、高度傳染性疾病，已知能自然或人工感染新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的鳥類超過了250種，現(xiàn)在已經(jīng)被國際獸疫局（OIE）列為法定應(yīng)報告的傳染病[1]。鴿子是介于家養(yǎng)和野生中間狀態(tài)的禽類，在新城疫傳播中起到重要的橋梁作用，而鴿新城疫是由鴿Ⅰ型副黏病毒（pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1）引起的一種高度接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一[2]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，PPMV-1是雞NDV的一種變異株[3]，該病毒首次于1981年在鴿體內(nèi)被分離到，其中基因Ⅵ型NDV被認(rèn)為是引起20世紀(jì)80年代初期新城疫第3次大流行的主要毒株，并在世界范圍內(nèi)陸續(xù)在鴿系野禽中流行[4]。

諸多分子流行病學(xué)研究表明，基因Ⅵ型NDV主要在鴿群中分離到，并且鴿群中分離到的NDV主要是基因Ⅵb亞型，與當(dāng)前世界上流行的優(yōu)勢基因Ⅶd亞型并不一致[5-6];此外，對雞而言，鴿體內(nèi)分離的強毒NDV一般被認(rèn)為是中等毒力病毒，這在一定程度上表明基因Ⅵb亞型NDV對其他家禽的傳播能力相對有限[7-8]。因此可以認(rèn)為，基因Ⅵb亞型NDV非常特殊、生物學(xué)意義重大，但是目前對基因Ⅵb亞型病毒的研究開展得還不夠深入，多局限于基因組序列測定、分析和主要蛋白的表達(dá)等層面。本試驗研究鴿源、雞源基因Ⅵ型NDV對鴿的致病性，并分析鴿感染2種病毒后的臨床診斷癥狀、病理變化、排毒規(guī)律等差異，以期了解它們在病毒攜帶和傳播中的作用，對于基因Ⅵ型NDV的研究和控制具有一定的現(xiàn)實指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株 基因Ⅵb亞型雞源NDV ZJ3、基因Ⅵb亞型鴿源NDV WX-10-07-Pi均由農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點開放實驗室分離、純化和保存。ZJ3、WX-10-07-Pi均為對雞中等毒力毒株，雞胚半數(shù)致死量ELD50（0.1 mL接種劑量）毒價分別為108.50、108.14。

1.1.2 雞胚及試驗動物 非免疫雞胚購自揚州市某非免疫雞場，自行孵化到所需日齡。2月齡非免疫美國白羽王鴿，購自江蘇省江都市飛亞肉鴿養(yǎng)殖基地。經(jīng)測定，試驗前所有試驗動物體內(nèi)均無NDV和禽流感病毒抗體。

1.1.3 運輸液 運輸液的配制是根據(jù)OIE推薦的配方[9]并稍作調(diào)整：用pH值為7.2的磷酸緩沖鹽（PBS）溶液配制運輸液，溶液中各種抗生素的劑量分別為青霉素10 000 U/mL，鏈霉素 10 mg/mL，慶大霉素250 μg/mL，卡那霉素250 μg/mL;最后用10mol/L濃度的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，使運輸液的pH值為7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組設(shè)計 將20羽2月齡的美國白羽王鴿分成2組，每組10羽，另取5羽作為陰性對照組隔離飼養(yǎng)，專人負(fù)責(zé)。試驗組鴿每羽滴鼻、點眼接種含1×106個ELD50病毒尿囊液。陰性對照組鴿接種同劑量的PBS。

1.2.2 臨診癥狀 接種后每天早晚定時觀察2次，持續(xù)觀察30 d，記錄試驗鴿的臨床癥狀及發(fā)病死亡情況。

1.2.3 喉頭和泄殖腔排毒檢測 接種后每天定時采集泄殖腔棉拭子及喉頭棉拭子，將棉拭子放入四抗PBS中，保存于-20 ℃。每份棉拭子接種3枚9～11日齡非免疫雞胚，每 12 h 觀察1次雞胚，觀察120 h。棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，將24 h以后死亡及120 h以后未死亡的雞胚置4 ℃冰箱過夜后收集尿囊液，測定其血凝價。

1.2.4 病理切片 分別于接種后4、7、14 d，每組隨機取2羽鴿子（對照組取1羽），進(jìn)行病理解剖，記錄剖解變化情況。采集氣管、腎臟、脾臟、肺臟、肝臟、胰腺、回腸、十二指腸、胸腺9種組織，用10%福爾馬林固定，按常規(guī)制作石蠟組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨診癥狀

病毒接種后3 d，WX-10-07-Pi、ZJ3感染組僅表現(xiàn)出輕微的精神狀態(tài)不佳。WX-10-07-Pi組于接種后4 d糞便呈現(xiàn)墨綠色;接種后6 d精神不振、食欲減退，大部分病鴿表現(xiàn)出翅膀懸垂或向兩側(cè)分開，兩腳麻痹、不能站立;接種后10 d出現(xiàn)眼瞼發(fā)炎、呼吸困難、咳嗽;在觀察期后期，出現(xiàn)輕微的震顫神經(jīng)癥狀。ZJ3組在感染后7 d糞便呈水樣稀糞;接種后9 d糞便呈墨綠色黏性稀糞;接種后12 d眼瞼發(fā)炎、眼睛半睜半閉，呼吸困難，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀;接種后15 d左右，出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，呈“觀星姿勢”;接種后20 d起神經(jīng)癥狀有所緩解。在1個月的試驗期內(nèi)，試驗組鴿發(fā)病率為100%，WX-10-07-Pi、ZJ3組均未見死亡，所有耐過的病鴿精神尚好，但明顯消瘦;陰性對照組鴿無異常表現(xiàn)。endprint

2.2 病理解剖學(xué)變化

WX-10-07-Pi感染組在接種后5 d脾臟輕微腫大，肝邊緣有出血點，氣管環(huán)輕微出血;雞接種后11 d氣管環(huán)嚴(yán)重出血。ZJ3感染組鴿在接種后3 d脾臟腫大，表面有針尖至粟粒大的灰白色的壞死結(jié)節(jié)或伴有出血點，肝臟稍腫;接種后 4 d 胰腺萎縮，肝臟邊緣、表面及心葉有出血點和出血紋，氣管充血、出血;接種后6 d肝臟呈土黃色。

2.3 泄殖腔和喉頭排毒檢測

每個泄殖腔棉拭子接種3枚9～11日齡非免疫雞胚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZJ3感染組的泄殖腔棉拭子中沒有檢測到病毒，而WX-10-07-Pi感染組的泄殖腔棉拭子中病毒分離率較高，結(jié)果見表1。由結(jié)果還可見，ZJ3組在接種后的1～4 d能檢測到喉頭間斷性排毒，WX-10-07-Pi組在接種后1至 5 d 檢測到喉頭持續(xù)排毒。

表1 病毒 WX-10-07-Pi感染后3～17 d泄殖腔棉拭子分離病毒結(jié)果

接種時間（d） 陽性鴿數(shù)（羽） 幸存鴿數(shù)（羽）

4 0 10

5 5 8

6 4 8

7 3 8

8 4 6

9 5 6

10 4 6

11 4 6

12 5 6

13 2 6

14 1 6

15 2 4

16 0 4

17 0 4

注：由于ZJ3感染組的泄殖腔棉拭子中未檢測出病毒，因此未在表中列出。

2.4 病理組織學(xué)變化

接種后，WX-10-07-Pi組鴿的脾臟、肺臟、十二指腸發(fā)生了明顯的病理組織學(xué)變化，ZJ3組的組織學(xué)病變主要為脾動脈周圍淋巴鞘淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、十二指腸絨毛黏膜層及固有層局部壞死脫落;對照鴿未見異常變化。具體組織病變詳見圖1至圖6，圖7至圖9為對照組肺、十二指腸、脾臟組織切片。

3 結(jié)論

不同宿主源基因Ⅵb亞型NDV同時感染鴿的試驗研究數(shù)據(jù)目前還比較缺乏，在本試驗中，用雞源毒株ZJ3、鴿源毒株WX-10-07-Pi分別感染美國白羽王鴿，均未引起感染鴿的死亡;ZJ3感染組出現(xiàn)疾病癥狀比WX-10-07-Pi感染組晚，但是臨床癥狀比WX-10-07-Pi嚴(yán)重許多，尤其是相關(guān)的神經(jīng)癥狀更為明顯，試驗結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道雞源強毒

NDV感染鴿未表現(xiàn)出任何臨床癥狀不一致[10]。大體病變結(jié)果表明，肝臟和脾臟是最先觀察到的病變部位，隨著病程發(fā)展，更多的臟器出現(xiàn)病變，但其出現(xiàn)比例和嚴(yán)重程度都不算很高。大體病變最明顯的區(qū)別是ZJ3感染組中肝臟呈現(xiàn)土黃色的病例較多，有個別病鴿雖然臨床診斷癥狀相當(dāng)嚴(yán)重，但大體病變卻并不顯著，與文獻(xiàn)報道的一致[11]。

盡管2株病毒對鴿的致病性相當(dāng)，但是ZJ3感染組泄殖腔卻沒有檢測到排毒，WX-10-07-Pi感染組的泄殖腔棉拭子中病毒分離率較高;喉頭排毒檢測結(jié)果表明，鴿源毒株WX-10-07-Pi帶毒時間長且排毒率明顯高于ZJ3感染組。這在一定程度上表明，鴿源NDV更容易在鴿群中傳播。此外，病鴿多種組織器官出現(xiàn)明顯的組織損傷，主要見于消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，但是出現(xiàn)病變的比例和嚴(yán)重程度都不高。WX-10-07-Pi組的肺臟發(fā)生組織學(xué)病變，而ZJ3組的肺臟正常，在一定程度上說明WX-10-07-Pi對鴿的呼吸道親嗜性較強。

從臨床癥狀、泄殖腔的排毒時間以及泄殖腔的病毒檢出率可以部分看出，同為基因Ⅵb亞型，鴿源NDV比雞源NDV更易在鴿群中傳播。這些結(jié)果一定程度上驗證了目前在我國，Ⅵb亞型是鴿群中所特有的基因型，且鴿源分離株絕大多數(shù)屬于該亞型的結(jié)論。

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