山東省雞源大腸埃希菌I類整合子及基因盒研究

魏秀麗+高迎春+陳玲+徐恩民+章安源+張琦

摘要：研究了從山東省濟南、德州等市肉雞場分離的大腸埃希菌中Ⅰ類整合子及基因盒的流行狀況。結果表明，整合酶基因檢出率為53%；Ⅰ類整合子基因盒檢出率為50%，大小為1 085～2 360 bp，100株細菌中各含1～2個基因盒，其中dfrA17+aadA5檢出率最高。Ⅰ類整合子在多重耐藥大腸埃希菌中廣泛流行，是細菌多重耐藥性產(chǎn)生和擴散的重要機制，養(yǎng)殖場應科學用藥，加強耐藥性監(jiān)測。

關鍵詞：整合子；基因盒；耐藥性；大腸埃希菌；雞源；山東

中圖分類號：S858.31文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0017-04

1989年Strokes和Hall首次提出整合子的概念。整合子存在于多種細菌中，是一種可移動的DNA元件，可捕獲、剪切和整合外源性耐藥基因并進行表達，且可以通過接合性質?；蜣D座子，使多重耐藥基因在細菌中擴散。整合子/基因盒系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)報道了60多種基因盒，以dfrA（甲氧芐氨嘧啶耐藥相關）和aadA（氨基糖苷類耐藥相關）基因家族為主，也在少數(shù)菌株中發(fā)現(xiàn)了aacA4、cmlA1、catB3、sat1以及blam-1基因盒編碼氨基糖苷類、氯霉素、鏈絲菌素、β-內(nèi)酰胺類等多種抗菌藥物[1]。目前，國內(nèi)外人源和動物源大腸埃希菌Ⅰ類整合子研究[1～12]雖然不少，但針對山東省肉雞養(yǎng)殖場的大腸埃希菌的研究尚未見報道。本試驗主要研究從濟南、德州、濟寧、淄博、聊城、煙臺、青島等市養(yǎng)雞場分離的大腸埃希菌中Ⅰ類整合子的分布，以探討Ⅰ類整合子耐藥基因盒在山東省有關市的養(yǎng)雞場的流行情況。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗菌株200株雞源大腸埃希菌，采自山東省各地市養(yǎng)雞場，由本研究室鑒定保存。

1.1.2試劑TaKaRa Ex Taq （5 U/μL），內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、AccⅠ、FokⅠ，DNA分子量標準：DL 2000 （50 ng/μL）、250 bp DNA ladder， 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3藥敏紙片抗生素藥敏紙片：磺胺甲基異惡唑/甲氧芐啶（SMZ/TMP）、慶大霉素、鏈霉素、壯觀霉素、強力霉素、氨芐西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、阿莫西林，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4試驗儀器PCR擴增儀（ABI公司）；電泳凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；水浴振蕩培養(yǎng)箱；數(shù)顯多槽循環(huán)水浴鍋；臺式高速離心機，全自動高壓滅菌器（日立）；超凈工作臺（蘇州凈化儀器設備有限公司）；冰箱（松下）。

1.2試驗方法

1.2.1引物的設計及PCR擴增根據(jù)GenBank收錄的Ⅰ類整合子序列，參考高迎春等[9]設計擴增Ⅰ類整合酶基因的引物intI-F、intI-R（預期擴增片段長度為280 bp）以及擴增可變區(qū)（基因盒）的引物gcst-F、gcst-R（擴增片段長度不等），由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。兩對引物各自在合適的PCR反應條件下進行擴增。引物序列、DNA模板的制備、PCR反應體系、PCR循環(huán)條件、PCR產(chǎn)物的電泳分析方法見參考文獻[9]。

1.2.2基因盒PCR產(chǎn)物測序每種基因盒選取3株大腸埃希菌，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序?；蚝袦y序結果經(jīng)Blastn檢索GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov），獲得同源信息，并分析其可能的功能。

1.2.3藥敏試驗按美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的K-B紙片擴散法檢測。

2結果與分析

2.1Ⅰ類整合酶基因的檢出情況

Ⅰ類整合酶基因PCR擴增結果見圖1。200株大腸埃希菌中有106株擴增到280 bp的目的

2.2基因盒的檢出情況及分析鑒定

挑選整合酶基因陽性菌株進行基因盒的擴增，結果見圖2。Ⅰ類整合子基因盒檢出了4種不同的目的片段，分別為1 085、1 740、1 989 bp和2 360 bp。

在GenBank中用Blastn對測序結果進行比對分析，結果表明檢出率較高的是鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因aadA2、aadA5和甲氧芐啶耐藥基因dfrA17、dfrA12。與吳聰明等[1～10]的檢測結果相符，同時與藥敏試驗中菌株對壯觀霉素、鏈霉素和SMZ/TMP的耐藥結果一致。

其中，有15株單獨攜帶1 989 bp的片段， 檢出率為7.5%，依次排列有二氫葉酸還原酶基因dfrA12和氨基糖苷-3′-腺苷轉移酶基因aadA2，介導細菌對甲氧芐啶和鏈霉素、壯觀霉素的耐藥性，在dfrA12和aadA2之間還有一閱讀框orfF。

15株單獨攜帶2 360 bp的片段， 檢出率為7.5%，包括編碼類似于志賀菌屬中的氯霉素外排泵的基因protein cmlA1-variant-like gene和乙酰轉移酶基因AAC（6′）-Ib （aacA4），介導細菌對氯霉素、鏈霉素和壯觀霉素的耐藥。

13株單獨攜帶1 740 bp的片段， 檢出率為6.5%，其中依次排列有二氫葉酸還原酶基因dfrA17和氨基糖苷-3′-腺苷轉移酶基因aadA5，介導細菌對甲氧芐啶和鏈霉素、壯觀霉素的耐藥性。

10株攜帶1 085 bp的片段，檢出率為5%，只含有aadA2基因，介導細菌對鏈霉素、壯觀霉素的耐藥性。

27株同時攜帶1 740 bp和2 360 bp的片段，檢出率為13.5%；

20株同時攜帶1 740 bp和1 989 bp的片段，檢出率為10.0%。

參照參考文獻[9]，基因測序結果與人類分離的相關基因的同源性高達98%。

2.3藥敏試驗及整合子/基因盒與耐藥表型的相互關系

200株大腸埃希菌對10種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。對強力霉素的耐藥率為52%（104株）；對SMZ/TMP的耐藥率為55%（110株）；對氯霉素的耐藥率為33%（66株）；對氨基糖苷類藥物的耐藥率為48%～65%；對氨芐西林耐藥率為45%（90株）；對阿莫西林的耐藥率為54%（108株）；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為42%～55%。且同類藥物間存在著部分交叉耐藥性，多重耐藥現(xiàn)象嚴重。

攜帶基因盒的菌株至少對4種藥物具有耐藥性，最多耐10種藥物。攜帶2 360 bp整合子的菌株100%同時對氯霉素、鏈霉素和壯觀霉素耐藥。攜帶1 085 bp整合子的菌株100%同時對鏈霉素和壯觀霉素耐藥；35株攜帶1 989 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和甲氧芐啶耐藥，但只有60%（21/35）的菌株對鏈霉素耐藥，40%的菌株對鏈霉素敏感，原因不明確；60株攜帶1 740 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和鏈霉素耐藥。100株攜帶整合子基因盒的菌株100%對磺胺甲基異惡唑和甲氧芐啶耐藥。由此可見大腸埃希菌攜帶的整合子/基因盒與耐藥表型密切相關。

3結論與討論

3.1在Ⅰ類整合子中共檢測到4種大小不同的片段，主要含有編碼對氯霉素、甲氧芐啶、壯觀霉素、鏈霉素耐藥性的基因盒?；蚝械目傮w攜帶率為50%，其中有47株菌同時攜帶2種不同的基因盒?；蚝袡z出率較高的是dfrA17+aadA5和protein cmlA1-variant-like gene、AAC（6′）-Ib，其次為dfrA12+aadA2和aadA2，這與其它報道耐藥大腸桿菌Ⅰ類整合子分布情況部分相符[1～10]。相關基因盒陽性的菌株，基因型和耐藥表型基本一致；攜帶基因盒的菌株對磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、甲氧芐啶耐藥；部分菌株對鏈霉素和壯觀霉素交叉耐藥?；蚝嘘幮缘牟糠志暧胁煌哪退幈硇停鐚娏γ顾?、氟喹諾酮類藥物和β-內(nèi)酰胺類的耐藥性，可能與其他耐藥機制如抗生素主動外排泵系統(tǒng)或位于其他DNA上的藥物水解酶、滅活酶、金屬酶、拓撲異構酶的改變等相關。

3.2cmlA氯霉素外排基因在志賀菌屬和銅綠假單胞菌中有類似的報道，但在大腸桿菌中報道較少。美國國立生物信息中心（NCBI）登記的cmlA基因多位于細菌整合子上，少數(shù)位于轉座子上，其表達產(chǎn)物CmlA轉運蛋白位于細菌內(nèi)膜[11，12]，它與細菌內(nèi)源性的外排系統(tǒng)共同作用，當整合子整合了外排泵基因和氨基糖苷類修飾酶乙酰轉移酶基因時，多重耐藥性更加嚴重。說明細菌的耐藥性往往不是單獨作用的，有些是幾種耐藥機制協(xié)同作用的結果，不同的耐藥基因通過整合子的組合、重新排列，不斷增生繁殖擴散，耐藥形勢更為嚴峻。

3.3一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒，同時一個基因盒可以整合到不同的整合子上，從而導致基因盒的移動[2，3]；且整合子攜帶的基因盒可以插入到轉座子或接合質粒中，在不同的細菌中運動從而擴散耐藥性。整合子及基因盒系統(tǒng)引起的耐藥性足以引起我們的高度重視，需積極采取相應的措施進行防范。氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物是臨床常用的藥物，山東省各地市養(yǎng)殖場因用藥習慣不同，耐藥性略有差異，但總體差異不顯著，多重耐藥結果相當嚴重。

3.4肉雞作為人類重要的蛋白質來源，是家庭餐桌的必備。但基因測序表明，雞源大腸桿菌整合子基因盒與人類分離的相關基因的同源性高達98%，不排除通過食物鏈或環(huán)境感染人的可能性。關于動物源耐藥菌通過環(huán)境或者食物鏈傳給人，引起人類治療失敗的案例逐年增多。在動物源耐藥菌對人類健康影響的風險評估中，后果評估是一個極其重要的組成部分，需要我們投入更多的資金和精力進行細致的調研及評估，完善風險評估系統(tǒng)以及風險預警系統(tǒng)。另外，需在養(yǎng)殖場通過藥敏試驗或耐藥基因監(jiān)測及時調整并科學合理地選擇藥物，不斷降低盲目用藥帶來的耐藥性風險，不斷提高畜禽產(chǎn)品質量安全和公共衛(wèi)生安全。

參考文獻：

[1]吳聰明，陳杖榴，曾振靈.豬場大腸桿菌Ⅰ型整合子及其基因盒的分子流行病學研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2005，24（4）：6-11.

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[5]李勁松，錢菊娣，項領，等.醫(yī)院感染革蘭陰性桿菌中整合子介導耐藥及水平播散機制研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2008，18（12）：1651-1655.

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[9]高迎春，魏秀青，魏秀麗，等.100株住院兒童大腸埃希菌Ⅰ類整合子研究[J].中國藥物應用與監(jiān)測，2011，8（2）：75-78.

[10]苑麗，潘玉善，吳華，等.雞源大腸桿菌整合子及基因盒分子流行病學研究[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32（6）：844-847.

[11]葉金艷，祝建軍，杜玉海，等.志賀菌屬分離株中發(fā)現(xiàn)氯霉素外排泵基因cmlA1[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2009，19（3）：271-273.

[12]George A M， Hall R M. Efflux of chloramphenicol by the CmlA1 protein[J]. FEMS Microbiology Letters， 2002， 209 （2）： 209-213.

200株大腸埃希菌對10種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。對強力霉素的耐藥率為52%（104株）；對SMZ/TMP的耐藥率為55%（110株）；對氯霉素的耐藥率為33%（66株）；對氨基糖苷類藥物的耐藥率為48%～65%；對氨芐西林耐藥率為45%（90株）；對阿莫西林的耐藥率為54%（108株）；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為42%～55%。且同類藥物間存在著部分交叉耐藥性，多重耐藥現(xiàn)象嚴重。

攜帶基因盒的菌株至少對4種藥物具有耐藥性，最多耐10種藥物。攜帶2 360 bp整合子的菌株100%同時對氯霉素、鏈霉素和壯觀霉素耐藥。攜帶1 085 bp整合子的菌株100%同時對鏈霉素和壯觀霉素耐藥；35株攜帶1 989 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和甲氧芐啶耐藥，但只有60%（21/35）的菌株對鏈霉素耐藥，40%的菌株對鏈霉素敏感，原因不明確；60株攜帶1 740 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和鏈霉素耐藥。100株攜帶整合子基因盒的菌株100%對磺胺甲基異惡唑和甲氧芐啶耐藥。由此可見大腸埃希菌攜帶的整合子/基因盒與耐藥表型密切相關。

3結論與討論

3.1在Ⅰ類整合子中共檢測到4種大小不同的片段，主要含有編碼對氯霉素、甲氧芐啶、壯觀霉素、鏈霉素耐藥性的基因盒?；蚝械目傮w攜帶率為50%，其中有47株菌同時攜帶2種不同的基因盒?；蚝袡z出率較高的是dfrA17+aadA5和protein cmlA1-variant-like gene、AAC（6′）-Ib，其次為dfrA12+aadA2和aadA2，這與其它報道耐藥大腸桿菌Ⅰ類整合子分布情況部分相符[1～10]。相關基因盒陽性的菌株，基因型和耐藥表型基本一致；攜帶基因盒的菌株對磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、甲氧芐啶耐藥；部分菌株對鏈霉素和壯觀霉素交叉耐藥?；蚝嘘幮缘牟糠志暧胁煌哪退幈硇停鐚娏γ顾?、氟喹諾酮類藥物和β-內(nèi)酰胺類的耐藥性，可能與其他耐藥機制如抗生素主動外排泵系統(tǒng)或位于其他DNA上的藥物水解酶、滅活酶、金屬酶、拓撲異構酶的改變等相關。

3.2cmlA氯霉素外排基因在志賀菌屬和銅綠假單胞菌中有類似的報道，但在大腸桿菌中報道較少。美國國立生物信息中心（NCBI）登記的cmlA基因多位于細菌整合子上，少數(shù)位于轉座子上，其表達產(chǎn)物CmlA轉運蛋白位于細菌內(nèi)膜[11，12]，它與細菌內(nèi)源性的外排系統(tǒng)共同作用，當整合子整合了外排泵基因和氨基糖苷類修飾酶乙酰轉移酶基因時，多重耐藥性更加嚴重。說明細菌的耐藥性往往不是單獨作用的，有些是幾種耐藥機制協(xié)同作用的結果，不同的耐藥基因通過整合子的組合、重新排列，不斷增生繁殖擴散，耐藥形勢更為嚴峻。

3.3一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒，同時一個基因盒可以整合到不同的整合子上，從而導致基因盒的移動[2，3]；且整合子攜帶的基因盒可以插入到轉座子或接合質粒中，在不同的細菌中運動從而擴散耐藥性。整合子及基因盒系統(tǒng)引起的耐藥性足以引起我們的高度重視，需積極采取相應的措施進行防范。氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物是臨床常用的藥物，山東省各地市養(yǎng)殖場因用藥習慣不同，耐藥性略有差異，但總體差異不顯著，多重耐藥結果相當嚴重。

3.4肉雞作為人類重要的蛋白質來源，是家庭餐桌的必備。但基因測序表明，雞源大腸桿菌整合子基因盒與人類分離的相關基因的同源性高達98%，不排除通過食物鏈或環(huán)境感染人的可能性。關于動物源耐藥菌通過環(huán)境或者食物鏈傳給人，引起人類治療失敗的案例逐年增多。在動物源耐藥菌對人類健康影響的風險評估中，后果評估是一個極其重要的組成部分，需要我們投入更多的資金和精力進行細致的調研及評估，完善風險評估系統(tǒng)以及風險預警系統(tǒng)。另外，需在養(yǎng)殖場通過藥敏試驗或耐藥基因監(jiān)測及時調整并科學合理地選擇藥物，不斷降低盲目用藥帶來的耐藥性風險，不斷提高畜禽產(chǎn)品質量安全和公共衛(wèi)生安全。

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[9]高迎春，魏秀青，魏秀麗，等.100株住院兒童大腸埃希菌Ⅰ類整合子研究[J].中國藥物應用與監(jiān)測，2011，8（2）：75-78.

[10]苑麗，潘玉善，吳華，等.雞源大腸桿菌整合子及基因盒分子流行病學研究[J].中國獸醫(yī)學報，2012，32（6）：844-847.

[11]葉金艷，祝建軍，杜玉海，等.志賀菌屬分離株中發(fā)現(xiàn)氯霉素外排泵基因cmlA1[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2009，19（3）：271-273.

[12]George A M， Hall R M. Efflux of chloramphenicol by the CmlA1 protein[J]. FEMS Microbiology Letters， 2002， 209 （2）： 209-213.

200株大腸埃希菌對10種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。對強力霉素的耐藥率為52%（104株）；對SMZ/TMP的耐藥率為55%（110株）；對氯霉素的耐藥率為33%（66株）；對氨基糖苷類藥物的耐藥率為48%～65%；對氨芐西林耐藥率為45%（90株）；對阿莫西林的耐藥率為54%（108株）；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為42%～55%。且同類藥物間存在著部分交叉耐藥性，多重耐藥現(xiàn)象嚴重。

攜帶基因盒的菌株至少對4種藥物具有耐藥性，最多耐10種藥物。攜帶2 360 bp整合子的菌株100%同時對氯霉素、鏈霉素和壯觀霉素耐藥。攜帶1 085 bp整合子的菌株100%同時對鏈霉素和壯觀霉素耐藥；35株攜帶1 989 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和甲氧芐啶耐藥，但只有60%（21/35）的菌株對鏈霉素耐藥，40%的菌株對鏈霉素敏感，原因不明確；60株攜帶1 740 bp整合子的菌株100%對壯觀霉素和鏈霉素耐藥。100株攜帶整合子基因盒的菌株100%對磺胺甲基異惡唑和甲氧芐啶耐藥。由此可見大腸埃希菌攜帶的整合子/基因盒與耐藥表型密切相關。

3結論與討論

3.1在Ⅰ類整合子中共檢測到4種大小不同的片段，主要含有編碼對氯霉素、甲氧芐啶、壯觀霉素、鏈霉素耐藥性的基因盒?；蚝械目傮w攜帶率為50%，其中有47株菌同時攜帶2種不同的基因盒?；蚝袡z出率較高的是dfrA17+aadA5和protein cmlA1-variant-like gene、AAC（6′）-Ib，其次為dfrA12+aadA2和aadA2，這與其它報道耐藥大腸桿菌Ⅰ類整合子分布情況部分相符[1～10]。相關基因盒陽性的菌株，基因型和耐藥表型基本一致；攜帶基因盒的菌株對磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、甲氧芐啶耐藥；部分菌株對鏈霉素和壯觀霉素交叉耐藥。基因盒陰性的部分菌株有不同的耐藥表型，如對強力霉素、氟喹諾酮類藥物和β-內(nèi)酰胺類的耐藥性，可能與其他耐藥機制如抗生素主動外排泵系統(tǒng)或位于其他DNA上的藥物水解酶、滅活酶、金屬酶、拓撲異構酶的改變等相關。

3.2cmlA氯霉素外排基因在志賀菌屬和銅綠假單胞菌中有類似的報道，但在大腸桿菌中報道較少。美國國立生物信息中心（NCBI）登記的cmlA基因多位于細菌整合子上，少數(shù)位于轉座子上，其表達產(chǎn)物CmlA轉運蛋白位于細菌內(nèi)膜[11，12]，它與細菌內(nèi)源性的外排系統(tǒng)共同作用，當整合子整合了外排泵基因和氨基糖苷類修飾酶乙酰轉移酶基因時，多重耐藥性更加嚴重。說明細菌的耐藥性往往不是單獨作用的，有些是幾種耐藥機制協(xié)同作用的結果，不同的耐藥基因通過整合子的組合、重新排列，不斷增生繁殖擴散，耐藥形勢更為嚴峻。

3.3一個整合子可以捕獲一個或多個基因盒，同時一個基因盒可以整合到不同的整合子上，從而導致基因盒的移動[2，3]；且整合子攜帶的基因盒可以插入到轉座子或接合質粒中，在不同的細菌中運動從而擴散耐藥性。整合子及基因盒系統(tǒng)引起的耐藥性足以引起我們的高度重視，需積極采取相應的措施進行防范。氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類藥物是臨床常用的藥物，山東省各地市養(yǎng)殖場因用藥習慣不同，耐藥性略有差異，但總體差異不顯著，多重耐藥結果相當嚴重。

3.4肉雞作為人類重要的蛋白質來源，是家庭餐桌的必備。但基因測序表明，雞源大腸桿菌整合子基因盒與人類分離的相關基因的同源性高達98%，不排除通過食物鏈或環(huán)境感染人的可能性。關于動物源耐藥菌通過環(huán)境或者食物鏈傳給人，引起人類治療失敗的案例逐年增多。在動物源耐藥菌對人類健康影響的風險評估中，后果評估是一個極其重要的組成部分，需要我們投入更多的資金和精力進行細致的調研及評估，完善風險評估系統(tǒng)以及風險預警系統(tǒng)。另外，需在養(yǎng)殖場通過藥敏試驗或耐藥基因監(jiān)測及時調整并科學合理地選擇藥物，不斷降低盲目用藥帶來的耐藥性風險，不斷提高畜禽產(chǎn)品質量安全和公共衛(wèi)生安全。

參考文獻：

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