地中海貧血的分子機(jī)制及其相關(guān)microRNA表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

孫士鵬 吳志奎 劉貴建

地中海貧血(thalassemia)是一種由珠蛋白基因的缺失或點突變所致的典型的單基因遺傳?。?］。此病最早發(fā)現(xiàn)于地中海區(qū)域，因而命名為地中海貧血，希臘語為thalassemia(thalassa翻譯為海，haima翻譯為血)。由于此病為遺傳性的珠蛋白合成障礙，我國自然科學(xué)名詞審定委員會建議地中海貧血的名稱為珠蛋白生成障礙性貧血。習(xí)慣上仍稱為地中海貧血，在東南亞和地中海區(qū)域此病的發(fā)病率和病死率很高。據(jù)估計全球每年至少有30萬名新生兒罹患鐮狀細(xì)胞貧血或地中海貧血［2］，在我國廣東、廣西、云南、四川等省份發(fā)病率較高。

一、地中海貧血的分類及分子機(jī)制

正常血紅蛋白為四聚體，由2個α鏈(α、ξ、θ)和2個非α鏈(β、δ、γ、ε)組成。成人體內(nèi)的血紅蛋白(HbA)有以下 3 種:HbA(α2β2)、HbF(α2γ2)和HbA2(α2δ2)。健康成人個體 HbF＜1%，HbA2為2.5% ～3．5%，胎兒血紅蛋白 (HbF)則主要由α鏈和γ鏈(HbF，α2γ2)構(gòu)成。珠蛋白編碼基因缺失或功能缺乏，使珠蛋白肽鏈合成減少，比例失調(diào)而導(dǎo)致的早期造血障礙即為地中海貧血。地中海貧血根據(jù)生成減少的珠蛋白肽鏈種類的進(jìn)行分類:如果α鏈合成減少稱為α地中海貧血，β鏈生成減少的稱為β地中海貧血［3］。由于過剩的珠蛋白鏈聚合、沉積于紅細(xì)胞膜，出現(xiàn)免疫損傷，誘發(fā)氧自由基反應(yīng)，引起繼發(fā)性酶和代謝異常，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力和機(jī)械穩(wěn)定性下降，最終導(dǎo)致溶血和無效造血。α和β地中海貧血較為常見，在我國廣西、廣東地區(qū)ɑ－地中海貧血的發(fā)生率達(dá)到8%以上，此外還有δβ型及δ型地中海貧血等類型。

1．α－地中海貧血的分子機(jī)制:α珠蛋白基因位于第16號染色體短臂上(16p13．33)，以5'－ζ－ψζ－ψα1－α2－α1－θ－3'順序排列，全長約30kb(圖1B)［4］。每條同源染色體上有兩個結(jié)構(gòu)基因，因此每對染色體上共有4個 α 基因，書寫為 αα/αα［4］。根據(jù)同一條染色體上的相鄰的兩個α珠蛋白基因中的缺失情況，可以把α－地中海貧血分為α+和α°兩種類型。相鄰的兩個α珠蛋白基因中1個發(fā)生缺失(基因型為－α/αα)或者點突變而喪失功能(基因型為αTα/αα)即為α+地中海貧血。兩個α珠蛋白基因均發(fā)生部分或完全缺失(基因型為－－/αα)稱為α°地中海貧血。根據(jù)1對(即兩條)染色體的α基因缺失狀態(tài)的不同組合，α地中海貧血又可分為以下幾類:①4基因均缺損的稱為重型地中海貧血(又稱Bart's水腫胎)。臨床表現(xiàn)是胎兒宮內(nèi)死亡，胎兒呈重度地中海貧血和水腫。通常這種類型的嬰兒的母親懷孕和產(chǎn)后易患毒血癥;②3個α基因缺損(基因型為－－/－α)，僅剩一個正常的α基因，稱為血紅蛋白H病?；颊邇H能合成少量α鏈，多余的β鏈則合成HbH(β4)，臨床表現(xiàn)是中度或貧血和脾大;③兩基因缺損(又稱為輕型地中海貧血)，病理生理改變輕微?；颊吲R床常上表現(xiàn)為輕度貧血;④單個基因缺損(又稱為靜止型地中海貧血)?；颊咭话悴槐憩F(xiàn)出臨床癥狀，血紅蛋白病理生理改變非常輕微，很難診斷到貧血所以稱為“靜止型”。靜止型α－地中海貧血往往是因為其子代罹患輕型地中海貧血或血紅蛋白H病而被推斷出來，當(dāng)然也可以通過特定DNA檢測進(jìn)行診斷。

圖1 珠蛋白編碼基因簇的染色體定位

2．β－地中海貧血的分子機(jī)制及分類:β－珠蛋白基因簇位于第11號染色體短臂上(11p15．5)，以5'－ε－Gγ－Aγ－ψβ－δ－β－3''順序排列，全長約40kb(圖1A)。臨床上，根據(jù)β珠蛋白肽鏈合成情況β－地中海貧血分為β+地中海貧血(β珠蛋白肽鏈合成減少)和β°地中海貧血(β珠蛋白肽鏈合成完全缺失)［5］。大多數(shù)情況下這種臨床分型分別同β珠蛋白編碼基因的純合子和雜合子狀態(tài)對應(yīng)，即1個β蛋白基因均發(fā)生缺損為β+地中海貧血，又稱為輕型β－地中海貧血;兩個β珠蛋白基因均發(fā)生缺損為重型β－地中海貧血。此外，小部分患者臨床癥狀介于兩者之間，臨床上稱之為中間型地中海貧血。

二、地中海貧血相關(guān)microRNA表達(dá)調(diào)控的研究

microRNA(miRNA)是一類長約19～24nt的非編碼單鏈小RNA分子，人類miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下，轉(zhuǎn)錄成初級miRNA(pri－miRNA)，在細(xì)胞核內(nèi)被切割成～70nt的miRNA前體(pre－miRNA)。隨后，pre－miRNA通過 RanGTP/Exportin 5的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)一步被切割加工稱為成熟的miRNA。在動物中，miRNA可以通過與靶基因3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而在細(xì)胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發(fā)育，并參與免疫反應(yīng)和多種疾病過程。據(jù)預(yù)測，miRNA能夠靶向30%的人類基因，調(diào)控50%的蛋白編碼基因。每個miRNA可能有200個以上的靶標(biāo)并直接影響數(shù)百個基因的翻譯。2008年，在人血清等體液中檢測到穩(wěn)定性良好的循環(huán)miRNA，可作為腫瘤等疾病診斷和治療的靶標(biāo)。進(jìn)一步資料表明，大部分循環(huán)miRNA以不同程度的與Argonaute 2(Ago 2)結(jié)合形成復(fù)合物的形式存在于微泡(microvesicles)和外體(exosomes)內(nèi)，作為細(xì)胞間通訊的傳送工具，通過微泡輸送給靶細(xì)胞并在靶細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行功能［6］。紅系細(xì)胞分化過程不同階段受到精確轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，miRNA無疑也參與了相關(guān)的調(diào)控。人粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞生成過程中的細(xì)胞以及紅細(xì)胞內(nèi)均可以檢測到miRNA。miR－144，miR－320和miR－451表達(dá)上調(diào)后能夠抑制紅細(xì)胞生成負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，抑制miR－15a、miR －24、miR －103、miR －150、miR －221、miR －222、miR－223和miR－224的表達(dá)則能增強(qiáng)紅細(xì)胞生成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平［7］。近年來，miRNA在地中海貧血等疾病過程中的表達(dá)情況和發(fā)揮的作用也逐漸揭示。一些研究通過對地中海貧血紅系分化過程中microRNA表達(dá)譜的分析可以確定篩選并鑒定出地中海貧血相關(guān)功能性miRNA。

Svasti等［8］發(fā)現(xiàn)β－地中海貧血患者早期紅系祖細(xì)胞的分化過程中miRNA－451表達(dá)失調(diào)。通過對地中海貧血患者分離培養(yǎng)的紅細(xì)胞前體細(xì)胞中miRNA－451表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)和正常人分離的細(xì)胞相比，地中海貧血患者培養(yǎng)中miRNA－451的表達(dá)水平分別是在第3天出現(xiàn)中度上調(diào)和在第12～14天顯著上調(diào)。然而研究者僅發(fā)現(xiàn)miRNA－451在地中海貧血患者紅系祖細(xì)胞分化中出現(xiàn)雙階段上調(diào)，其具體功能和作用機(jī)制還需要后續(xù)研究進(jìn)行解釋。

Bianchi等［9］使用miRNA芯片對地中海貧血患者(其中1例為缺失型遺傳持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征(HPFH))胎兒紅細(xì)胞前體內(nèi)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)HPFH患者紅細(xì)胞前體內(nèi)miR－210高表達(dá)。進(jìn)一步通過對普卡霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞和紅細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)miR－210的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平對普卡霉素誘導(dǎo)時間和劑量具有依賴性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)miR－210表達(dá)水平的增加同胎兒γ珠蛋白基因的表達(dá)增加一致，這說明miR－210很可能參與了紅系細(xì)胞分化過程中γ珠蛋白的表達(dá)調(diào)控，但這還需要進(jìn)一步實驗證實。最近，Sarakul等［10］發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下，K562細(xì)胞分化過程中miR－210表達(dá)顯著上調(diào)。在缺氧條件下K562細(xì)胞培養(yǎng)72h，細(xì)胞內(nèi) miR－210表達(dá)水平為正常含氧量培養(yǎng)條件下K562細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的7．03±2．40倍。正常含氧量條件下培養(yǎng)的正常紅系細(xì)胞和β－地中海貧血紅系祖細(xì)胞在第9天時miR－210的表達(dá)量均為最高，互相比較發(fā)現(xiàn)地中海貧血紅系祖細(xì)胞內(nèi)miR－210的表達(dá)量為正常紅系祖細(xì)胞的5倍;在缺氧條件下，β－地中海貧血紅系祖細(xì)胞內(nèi)miR－210的表達(dá)量則為正常紅系祖細(xì)胞表達(dá)量的7倍。缺氧環(huán)境還能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的地中海貧血患者的成熟紅細(xì)胞(CD71－/CD235a+)增加，轉(zhuǎn)染anti－miR－210至紅系祖細(xì)胞抑制miR－210的功能后這種現(xiàn)象被抑制，而且細(xì)胞內(nèi)的α－、β－和γ－珠蛋白表達(dá)量也明顯下降。不過，研究者通過生物信息學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)miR－210直接調(diào)控珠蛋白表達(dá)的證據(jù)，因而miR－210調(diào)控珠蛋白表達(dá)的機(jī)制究竟通過何種機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來揭示。

紅細(xì)胞生成過程中miR－503參與調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和凋亡［11，12］。Roy 等［13］對 CD34+造血干細(xì)胞體外分化得到的CD235a+紅細(xì)胞內(nèi)miR－503進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)同正常樣本相比，β－地中海貧血患者細(xì)胞內(nèi)miR－503表達(dá)的水平顯著下調(diào)(重型β－地中海貧血患者P=0.000，E－β重型地中海貧血P=0.003，E－β中間型地中海貧血P=0．003)。病情越重則miR－503表達(dá)水平越低。研究者認(rèn)為正常情況下miR－503能通過抑制細(xì)胞增殖基因CDC25A的表達(dá)使紅細(xì)胞的細(xì)胞周期靜止。由于地中海貧血患者紅細(xì)胞分化過程中miR－503表達(dá)量很低，則不能夠有效抑制CDC25A的功能進(jìn)而導(dǎo)致無效紅細(xì)胞的生成和過度增殖。

BCL11A是一種高度保守的鋅指蛋白，為B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞正常發(fā)育所必需。近期遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)BCL11A是人體發(fā)育過程中血紅蛋白的轉(zhuǎn)換開關(guān)和成人γ珠蛋白表達(dá)抑制因子。miR－486－3p能夠負(fù)性調(diào)控 BCL11A的表達(dá)，Lulli等［14］發(fā)現(xiàn) β －地中海貧血患者外周血中分離獲得的定向誘導(dǎo)紅細(xì)胞內(nèi)miR－486－3p表達(dá)量上調(diào)，其靶標(biāo)BCL11A的mRNA和蛋白質(zhì)含量則對應(yīng)下調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)地中海貧血患者紅細(xì)胞內(nèi)γ珠蛋白表達(dá)水平也顯著高于正常對照組。此結(jié)果說明miR－486－3p的表達(dá)能夠通過抑制BCL11A的功能，進(jìn)而促進(jìn)地中海貧血患者γ珠蛋白的表達(dá)。研究者認(rèn)為miR－486－3p的表達(dá)水平還可能與β－地中海貧血的嚴(yán)重程度相關(guān)。

筆者課題組吳志奎教授首次提出“先天稟賦不足，腎虛髓損，精血化生無源”是地中海貧血的中醫(yī)核心病機(jī)，“腎生髓、髓生血”是治療的理論基礎(chǔ)，應(yīng)從腎論治采用補(bǔ)腎益髓法:以滋腎養(yǎng)肝、益精生血、健脾補(bǔ)氣、逍痞退黃為治療原則，用補(bǔ)腎益髓法代表方——益髓生血顆粒在廣西高發(fā)區(qū)治療β－地中海貧血取得可重復(fù)的肯定療效［15］。課題組從整體效應(yīng)、基因突變與療效關(guān)系、骨髓有效造血、紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、調(diào)控珠蛋白mRNA表達(dá)等不同層面，探討了中藥治療地中海貧血療效特點和作用靶點的分子機(jī)制，首次提出中藥治療地中海貧血不改變基因突變型，而是修飾、調(diào)控功能基因表達(dá)，改善珠蛋白鏈比，減低紅細(xì)胞包涵體，誘導(dǎo)紅系分化，促進(jìn)骨髓有效造血［16］。研究結(jié)果使中藥治療地中海貧血整體水平達(dá)到新的高度。最近，張俊武等［17］對益髓生血顆粒一些純化的組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大黃素能夠促進(jìn)K562細(xì)胞內(nèi)CD235a和CD71以及α－、ε－和 γ－珠蛋白的表達(dá)，并能通過下調(diào)miR－221和miR－222的表達(dá)水平來調(diào)控紅細(xì)胞分化。此結(jié)果說明地中海貧血相關(guān)miRNA的研究能從一個側(cè)面揭示中醫(yī)藥治療相關(guān)疾病的分子機(jī)制。

三、展 望

地中海貧血是一種由珠蛋白基因缺失或點突變所致的典型的單基因遺傳病，在地中海區(qū)域及我國南方危害很大，目前國內(nèi)外治療方法有限。通過高通量二代測序技術(shù)和miRNA芯片分析技術(shù)篩選出疾病相關(guān)異常表達(dá)miRNA，再通過大樣本量實時熒光定量PCR驗證和后續(xù)靶基因預(yù)測分析及靶蛋白表達(dá)的檢測等分子生物學(xué)技術(shù)，將能夠更深入地揭示地中海貧血相關(guān)miRNA的表達(dá)情況和相關(guān)機(jī)制，很有可能給地中海貧血的治療帶來新的靶點，也能為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵的研究提供新的研究思路。

1 Rachmilewitz EA，Giardina PJ．How I treat thalassemia［J］．Blood，2011，118(13):3479－3488

2 Modell B，Darlison M．Global epidemiology of haemoglobin disorders and derived service indicators［J］．Bull World Health Organ，2008，86(6):480－487

3 Forget BG．Preface thalassemia［J］．Hematol Oncol Clin North Am，2010(6)，24:xiii－xv

4 Denic S，F(xiàn)rampton C，Nagelkerke N，et al．Consanguinity affects selection of alpha－thalassemia genotypes and the size of populations under selection pressure from malaria［J］．Ann Hum Biol，2007，34:620－631

5 Estevao IF，Peitl Junior P，Bonini－Domingos CR．Serum ferritin and transferrin saturation levels in β0 and β (+)thalassemia patients［J］．Genet Mol Res，2011，10(6):632－639

6 Li L，Zhu D，Huang L，et al．Argonaute 2 complexes selectively protect the circulating microRNAs in cell－ secreted microvesicles［J］．PLoS One，2012，7(10):e46957

7 Lawrie CH．microRNA expression in erythropoiesis and erythroid disorders［J］．Br J．Haematol．2010，150(2):144 － 151

8 Svasti S，Masaki S，Penglong T，et al．Expression of microRNA －451 in normal and thalassemic erythropoiesis［J］．Ann Hematol，2010，89(10):953－958

9 Bianchi N，Zuccato C，Lampronti I，et al．Expression of miR －210 during erythroid differentiation and induction of gamma－globin gene expression［J］．BMB Rep，2009，42(8):493 －499

10 Sarakul O，Vattanaviboon P，Tanaka Y，et al．Enhanced erythroid cell differentiation in hypoxic condition is in part contributed by miR－210 ［J］．Blood Cells Mol Dis，2013，51(2):98 －103

11 Forrest AR，Kanamori－Katayama M，Tomaru Y，et al．Induction of microRNAs，mir－155，mir－222，mir－424 and mir－503，promotes onocytic differentiation through ombinatorial regulation［J］．Leukemia，2010，24(6):460 －466

12 Nie Y，Han BM，Liu XB，et al．Identification of Micro－ RNAs involved in hypoxia－and serum deprivation－induced apoptosis in mesenchymal tem cells［J］．Int J Biol Sci，2011，7(6):762 －768

13 Roy P，Bhattacharya G，Lahiri A，et al．hsa－miR －503 is downregulated in β thalassemia major［J］．Acta Haematol，2012，128(3):187－189

14 Lulli V，Romania P，Morsilli O，et al．MicroRNA －486－3p regulates γ－globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A［J］．PLoS One，2013，8(4):e60436

15 吳志奎．地中海貧血癥的中醫(yī)病機(jī)與治則治法［J］．中醫(yī)雜志，2009，50(1):73 －75

16 Wang WJ，Wu ZK，Zhang XH，et al．Effect of Yisuishengxue granule on the oxidative damage of erythrocytes with hemoglobin H disease［J］．Chin J Integr，2012，18(9):670 － 675

17 Ma YN，Chen MT，Wu ZK，et al．Emodin can induce K562 cells to erythroid differentiation and improve the expression of globin genes［J］．Mol Cell Biochem，2013，382(1 －2):127 －136