ERα通過MTA3調(diào)控EMT影響HCC細胞凋亡的研究

張宇華 胡智明 張成武 吳偉頂 劉 杰 尚敏杰 趙大建

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病死率高，每年全球50萬以上患者診斷為原發(fā)性肝癌，HCC約占原發(fā)性肝癌的85%［1］。我國是HCC高發(fā)區(qū)，發(fā)病人數(shù)約占全球55%，在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，手術治療是目前治療效果最佳、唯一有可能治愈的方案，但是5年內(nèi)再次發(fā)現(xiàn)腫瘤的概率為75%［2］。進展期肝癌目前無有效治療方案，放化療對HCC無效。分子靶向治療是目前發(fā)展十分迅速的一個領域，但索拉菲尼是一種小分子多激酶抑制劑，僅能使37%患者延長生存期2～3個月［3］。雌激素在HCC發(fā)生發(fā)展中起作用，但目前對此方面的研究不多。上皮間質(zhì)轉換(epithelial－mesenchymal transition，EMT)為目前腫瘤研究的熱點，影響多種腫瘤的轉移及進展，而雌激素受體 α(Estrogen receptorα，ERα)通過調(diào)控 Snail、E－cadherin(EMT重要調(diào)控因子)調(diào)控EMT已經(jīng)在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌等中被證實，但在HCC中，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關ERα調(diào)控EMT的報道。筆者通過檢測雌二醇、氟維司瓊作用于HCC細胞后 MTA3、Snail、E－cadherin和 BAX表達變化，明確 ERα通過 ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信號通路影響 HCC細胞 EMT，進而影響HCC細胞凋亡的機制，為針對ERα的治療應用于HCC提供理論基礎。

材料與方法

1．HCC細胞:HCC 細胞株:HepG2、SMMC －7721(中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫)。

2．細胞培養(yǎng):HepG2、SMMC－7721細胞于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素)(杭州四季青)37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。

3．Western blot:按照常規(guī)方法提取細胞總蛋白、定量。蛋白變性后10%SDS－聚丙烯膠收集+5%SDS－聚丙烯膠分離，蛋白濕轉至 PVDF 膜，脫脂奶封閉后，ERα、MTA3、Snail、E－cadherin、BAX(Santa Cruz Biotechnology公司)4℃振蕩孵育過夜，二抗(抗兔或抗鼠IgG，Santa Cruz Biotechnology公司)室溫孵育1h，ECL顯色。β－actin(Santa Cruz Biotechnology公司)作為內(nèi)參照。

4．分組及干預藥物濃度:HepG2、SMMC－7721細胞在無酚紅培養(yǎng)液中調(diào)節(jié)細胞濃度為2．0×106個/毫升?？瞻讓φ战M無酚紅培養(yǎng)液培養(yǎng);藥物干預組濃度:雌二醇(Sigma，德國)濃度:10－9mol/L、10－8mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L;氟維司瓊(Sigma公司，德國)濃度:10－9mol/L、10－8mol/L、10－7mol/L、10－6mol/L。藥物干預48h后測定各目標基因的相對濃度。

5．引物設計:采用Primer 5．0引物設計軟件和引物設計原則進行引物的設計，然后由上海生物工程有限公司負責合成:引物序列:ERα:SE:5'－AATgATTCTATAATgCCATCATg-CAgC －3'，AS:5'－gCTTggTTAAACATATCTgCAAggTTAC －3';MTA3:SE:5'－TgAggCTgAggAggAggC －3'，AS:5'－CTTCTATCCTTCTTATTAggTATgggTTgC－3';Snai:SE:5'－gAggCggTggCAgACTAg－3'，AS:5'－gACACATCggTCAgACCAg－3';E－cadherin:SE:5'－gAATCCAAAgCCTCAggTCA －3'，AS:5'－TgTAgTCACCCACCTCTAAg－3';BAX:SE:5'－AACTggACAgTAACATgg－3'，AS:5'－CTTATAgACCACATCTgA －3';β－actin:SE:5'－gATgCTgCTTACATgTCTCg－3'，AS:5'－CCAgCAgAgAATggAAAgTC －3'。

6．PCR反應條件:Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測RNA純度和濃度。cDNA合成:用反轉錄酶合成cDNA，按試劑盒操作。實時定量PCR反應參數(shù):95℃，5min;95℃，20s;55℃，20s;72℃，30s;共35個循環(huán)。所有實驗重復3次。PCR產(chǎn)物以曲線起翹值(Ct值)作為分析依據(jù)。在ABI7500軟件體系中調(diào)整基線和閾值，讀出各反應孔Ct值。以β－actin作為內(nèi)對照。根據(jù)靶基因及β－actin基因Ct值計算△Ct進行分析，△Ct=2^(β－actin基因的Ct值－靶基因的Ct值)，△Ct值越高，表達越低。

7．統(tǒng)計學方法:SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，統(tǒng)計學分析用獨立樣本t檢驗，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．HCC 細胞中 ERα、MTA3、Snail、E －cadherin、BAX在基因和蛋白層面的表達:從圖1可以發(fā)現(xiàn)HepG2細胞有 ERα表達，而 SMMC－7721細胞基本無 ERα 表達;MTA3、Snail、E －cadherin、BAX 在兩個細胞株中均有表達，MTA3在兩個細胞株中表達無明顯差異;HepG2細胞中Snail表達低，E－cadherin表達高;而SMMC－7721細胞中Snail表達高，E－cadherin表達低;BAX在兩株細胞中無明顯差異。

圖1 ERα、MTA3、Snail、E －cadherin、BAX 在 HCC細胞株HepG2、SMMC－7721中的表達

2．Real－time PCR法:檢測HCC細胞經(jīng)過雌二醇、氟維司瓊作用后，MTA3、Snail、E －cadherin和BAX mRNA的表達水平的變化。HCC細胞株HepG2和SMMC－7721經(jīng)不同濃度雌二醇、氟維司瓊作用48h后，MTA3基因表達的變化。HepG2細胞經(jīng)過不同濃度雌二醇處理后，隨著雌二醇濃度升高，MTA3基因△Ct下降，表達升高，各組間表達有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，圖2A)，而 SMMC －7721細胞 MTA3則無明顯統(tǒng)計學意義。HCC細胞經(jīng)過不同濃度氟維司瓊作用48h后，隨著濃度升高，HepG2細胞MTA3表達下降(P＜0．05，圖2B)，而 SMMC －7721細胞 MTA3表達改變無統(tǒng)計學差異(圖2)。HCC細胞株HepG2和SMMC－7721經(jīng)不同濃度雌二醇、氟維司瓊作用48h后，Snail基因表達的變化。HepG2細胞經(jīng)過不同濃度雌二醇處理后，隨著雌二醇濃度升高，Snail基因△Ct上升，表達下降，各組間表達有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，圖3A)，而 SMMC －7721細胞 MTA3 則無明顯統(tǒng)計學意義。HCC細胞經(jīng)過不同濃度氟維司瓊作用48h后，隨著濃度升高，HepG2細胞Snail表達上升(P＜0．05，圖3B)，而 SMMC －7721 細胞 Snail表達改變無統(tǒng)計學差異(圖3)。HCC細胞株HepG2和SMMC－7721經(jīng)不同濃度雌二醇、氟維司瓊作用48h后，E－cadherin基因表達的變化。HepG2細胞經(jīng)過不同濃度雌二醇處理后，隨著雌二醇濃度升高，E－cadherin基因△Ct下降，表達升高，各組間表達有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，圖 4A)，而 SMMC－7721細胞 E－cadherin則無明顯統(tǒng)計學意義。HCC細胞經(jīng)過不同濃度氟維司瓊作用48h后，隨著濃度升高，HepG2細胞E －cadherin表達下降(P ＜0．05，圖4B)，而SMMC－7721細胞E－cadherin表達改變無明顯統(tǒng)計學差別(圖4)。HCC細胞株HepG2和SMMC－7721經(jīng)不同濃度雌二醇、氟維司瓊作用48h后，BAX基因表達的變化。HepG2細胞經(jīng)過不同濃度雌二醇處理后，隨著雌二醇濃度升高，BAX基因△Ct下降，表達升高，各組間表達有統(tǒng)計學意義(P＜0．05，圖 5A)，而SMMC－7721細胞BAX則無明顯統(tǒng)計學意義。HCC細胞經(jīng)過不同濃度氟維司瓊作用48h后，隨著濃度升高，HepG2細胞BAX表達下降(P ＜0．05，圖5B)，而SMMC－7721細胞BAX表達改變無明顯統(tǒng)計學差別(圖5)。

圖2 雌二醇和氟維司瓊處理HepG2和SMMC－7721細胞后經(jīng)real－time PCR檢測后MTA3基因表達(△Ct)的變化

討 論

HCC總體治療效果仍不滿意。手術治療是目前治療效果最佳、唯一有可能治愈的方案，但是5年內(nèi)腫瘤復發(fā)率為75%［2］。進展期肝癌目前無有效治療方案，全身化療對HCC無效。分子靶向治療是目前發(fā)展十分迅速的一個領域，索拉菲尼是一種低分子多激酶抑制劑，2007年FDA批準可使用于不能切除的晚期肝癌，與安慰劑相比，能使37%患者延長生存期2 ～3 個月［3］。其他尚有 brivanib、erlotinib、bevacizumab等分子靶向藥物正進行臨床研究，盡管目前HCC分子靶向治療發(fā)展十分迅速，但進展期肝癌總體療效不佳。

圖3 雌二醇和氟維司瓊處理HepG2和SMMC－7721細胞后經(jīng)real－time PCR檢測后Snail基因表達(△Ct)的變化

圖4 雌二醇和氟維司瓊處理HepG2和SMMC－7721細胞后經(jīng)real－time PCR檢測后E－cadherin基因表達(△Ct)的變化

圖5 雌二醇和氟維司瓊處理HepG2和SMMC－7721細胞后經(jīng)real－time PCR檢測后BAX基因表達(△Ct)的變化

EMT是目前腫瘤研究的熱點之一，EMT能使腫瘤細胞侵襲力更強，惡性程度更高，耐藥性更強，預后更差，抑制EMT也是下一步腫瘤治療的關鍵之一［4］。肝細胞雖不是上皮細胞，但其表現(xiàn)出極性并相互粘連，呈現(xiàn)上皮細胞特性。已有大量文獻證實EMT在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，EMT被認為是從肝硬化向肝癌轉移的橋梁，EMT指標能在肝硬化中發(fā)現(xiàn)，并在肝癌患者中表達增強，而在HCC伴轉移的患者中表達最強［5，6］。目前已證實Snail為EMT中最重要的調(diào)控因子，Snail表達升高預示 EMT 被激活［4，7］。而 E －cadherin 是 Snail下游受體，受 Snail抑制，E－cadherin被認為是 EMT的直接調(diào)控因子，E－cadherin表達下降提示EMT被激活［4，8］。

雌激素在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起作用，男性HCC發(fā)病率明顯比女性高，約為3～5倍，在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)類似的情況，使用二乙基亞硝胺誘導小鼠HCC，在雄性小鼠中100%誘導而雌性小鼠中僅10%～30%誘導成功［9］。以上結果提示雌激素在HCC發(fā)生發(fā)展中起作用，能抑制HCC的發(fā)生進展，但目前對此機制的研究不多。Nakatani等［10］和Naugler等［11］發(fā)現(xiàn)雌激素能通過抑制白介素6抑制二乙基亞硝胺誘導的肝損害，并抑制HCC在雄性小鼠中的發(fā)展。ERα通過Snail、E－cadherin調(diào)節(jié)EMT在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等激素密切相關的腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)，ERα 高表達抑制 EMT，改善腫瘤預后［12］。但筆者未發(fā)現(xiàn)ERα在HCC中調(diào)節(jié)EMT相關的報道。

筆者首先在HCC細胞中通過RT－PCR及Western blot顯示 MTA3、ERα、Snail、E －cadherin、BAX 在HCC細胞中存在并表達，結果提示ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信號通路中各個因子在HCC細胞中存在。在 HepG2細胞中，ERα表達明顯高于SMMC－7721(圖1)。然后筆者通過雌二醇激活ERα后，real－time PCR發(fā)現(xiàn)在ERα高表達的HepG2細胞中，MTA3表達上升，Snail表達則受抑制、E－cadherin表達上調(diào)(P＜0．05)，EMT被抑制。而在ERα低表達的SMMC－7721細胞中，則沒有明顯改變。通過氟維司瓊處理后，HepG2細胞MTA3表達下降，Snail表達上升、E－cadherin表達下調(diào)(P＜0.05)，EMT被激活(圖2)。筆者得到的結果與Fujita等［12］在乳腺癌細胞中獲得的結果類似，雌二醇可以通過激活ERα，抑制 Snail，激活E－cadherin而抑制EMT，而氟維司瓊則可以起到相反的作用。然后筆者又檢測了凋亡相關因子BAX的表達，ERα激活后，EMT被抑制，BAX表達增加，腫瘤細胞凋亡激活，而通過氟維司瓊抑制ERα后，EMT被激活，BAX表達降低，細胞凋亡被抑制。本研究實驗結果提示在ERα高表達的肝癌細胞株中，雌激素可以通過激活ERα，激活 MTA3，抑制 Snail，激活 E －cadherin，從而抑制這些HCC細胞株的EMT，同時激活了腫瘤細胞的凋亡。這個結果解釋了雌激素在部分HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的抑制HCC生長發(fā)展的作用，與其他學者所報道的ERα在HCC發(fā)展中的角色相符［9～11］。但HCC發(fā)展，特別是進展期HCC的發(fā)展過程往往是一個多基因調(diào)控的過程，本結果僅提示了在部分ERα表達陽性的HCC中，ERα可以作為一個潛在的治療靶點。

通過以上結果，筆者認為ERα→MTA3→Snail→E－cadherin信號通路在部分HCC細胞中存在并調(diào)控EMT，與腫瘤凋亡相關。在ERα高表達的HCC細胞中，ERα可以作為一個靶點對此通路進行干預。雌二醇通過激活ERα進而抑制EMT，激活腫瘤凋亡，抑制HCC的發(fā)展，而氟維司瓊則可以起到相反的作用。本結果拓展了HCC治療的思路，在HCC細胞中證明了雌二醇抑制EMT的機制，下一步需要在體內(nèi)實驗中進一步驗證。

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