量子點(diǎn)聯(lián)合磁微粒技術(shù)檢測HBsAg方法的建立及評(píng)價(jià)

何紫琪 李從榮 楊艷兵 吳 青 余 華

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)因其發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、傳播面廣，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。據(jù)WHO報(bào)道，全世界大約有20億人曾經(jīng)感染過HBV，超過2．4億的患者發(fā)展為慢性化，每年約有60萬人因急、慢性HBV感染而死亡［1］。乙型肝炎患者主要集聚在亞洲，該地區(qū)大多數(shù)人在兒童時(shí)期就感染HBV，8% ～10%的成人發(fā)展為慢性感染者，在中國更為嚴(yán)重［1］。HBV主要通過血液傳播，因此要對獻(xiàn)血員進(jìn)行嚴(yán)格的HBsAg篩查，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(原衛(wèi)生部)出臺(tái)的《獻(xiàn)血者健康檢查要求》規(guī)定:獻(xiàn)血者要進(jìn)行HBsAg的檢測。HBsAg是HBV感染最早出現(xiàn)的免疫學(xué)標(biāo)志物，HBsAg檢測可以縮短病原檢出的“窗口期”，也能避免感染恢復(fù)后假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，是病原體診斷的趨勢所在。本研究擬利用量子點(diǎn)與磁微粒的特性，建立一種便捷、高靈敏度的HBsAg的檢測方法。

材料與方法

1．試劑和儀器:發(fā)射波長為605nm的鏈霉親和素化CdSe/Zns硒化鎘量子點(diǎn)(武漢珈源量子點(diǎn)公司)、粒徑3 μm的xMagTM異硫氰酸根末端磁微粒(陜西北美基因股份有限公司)、HBsAg adr protein、生物素化兔抗 HBsAg－IgG、鼠抗 HB-sAg－IgG(英國Abcam公司)。DDHZ－300型恒溫振蕩器(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、磁選分離器(西北美基因股份有限公司)、EURO StarⅡ型熒光顯微鏡(德國EURO公司)、BIORAD680型酶標(biāo)儀(美國BIO RAD公司)。

2．方法:(1)磁微粒(MMS)與抗體偶聯(lián):嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行MMS的活化、抗體偶聯(lián)、清洗和封閉，分別以不同濃度的鼠抗 HBsAg－IgG 與 MMS偶聯(lián)，以(OD原始抗體－OD清洗液)/OD原始抗體計(jì)算連接效率，并選擇最合適的抗體濃度。(2)量子點(diǎn)(QD)與抗體連接方法學(xué)的建立:用pH值7．2的PBS緩沖液以1∶500稀釋鏈霉親和素化的量子點(diǎn)，4℃保存?zhèn)溆?。用不同濃度生物素化兔抗HBsAg－IgG連接QD，37℃振蕩反應(yīng)15min;將QD－單抗復(fù)合物進(jìn)行高速離心，取上清液行蛋白含量檢測，以(OD原始抗體－OD清洗液)/OD原始抗體計(jì)算連接效率，并選擇最適抗體濃度。(3)HBsAg檢測體系的建立:取5μl MMS－單抗復(fù)合物與100μl QD－多抗復(fù)合物置于1．5ml EP管內(nèi)，加入不同濃度的HBsAg，用正常人血清作為陰性對照，37℃振蕩反應(yīng)，分別于5、10、20、30、40、60、120min 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行磁分離并洗滌，重懸至100μl。取20 μl于熒光顯微鏡下檢測熒光。(4)臨床應(yīng)用評(píng)價(jià):隨機(jī)抽取筆者醫(yī)院HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗體陽性患者的血清，以及脂血、溶血、黃疸標(biāo)本，用上述方法檢測，觀察有無交叉反應(yīng)。隨機(jī)抽取筆者醫(yī)院HBV DNA陽性、陰性患者血清標(biāo)本各60例(經(jīng)qPCR定量)，用上述方法檢測，并與qPCR、ELISA法比較，評(píng)價(jià)其HBsAg的檢測效率。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17．0軟件，不同方法檢測率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．MMS、QD偶聯(lián)抗體最佳濃度:MMS偶聯(lián)鼠抗HBsAg－IgG的效率在其濃度≤50μg/ml時(shí)，維持在43% ～56%，當(dāng)抗體濃度超過50μg/ml時(shí)，MMS偶聯(lián)效率降低，故以50μg/ml作為偶聯(lián)磁微粒的抗體最佳濃度。QD偶聯(lián)生物素化兔抗HBsAg－IgG的效率在其濃度≤25μg/ml時(shí)，維持在37% ～49%，當(dāng)抗體濃度超過25μg/ml時(shí)，QD偶聯(lián)效率降低，故以25μg/ml作為偶聯(lián)量子點(diǎn)的抗體最佳濃度。

2．HBsAg檢測體系:觀察免疫反應(yīng)時(shí)間對檢測結(jié)果的影響發(fā)現(xiàn)，30min后可觀察到穩(wěn)定的熒光。當(dāng)HBsAg濃度為1ng/ml時(shí)，可以檢測到熒光。當(dāng)濃度≥30ng/ml時(shí)，鏡下觀察熒光趨于穩(wěn)定，認(rèn)為抗體已完全消耗。熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下量子點(diǎn)磁微?？乖瓘?fù)合物

3．臨床應(yīng)用評(píng)價(jià):HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗體陽性患者的血清標(biāo)中均未發(fā)現(xiàn)熒光，溶血、脂血、黃疸標(biāo)本中也未檢出熒光。60例HBV DNA陽性患者血清中有4例未檢出熒光，60例陰性患者血清檢有8例檢出熒光，ELISA法檢測結(jié)果與本研究方法結(jié)果一致(表1)(P＜0．05)。以熒光定量PCR方法作為參照方法，本方法檢測HBsAg的敏感度、特異性分別為 93．3%(56/60)、86．7%(52/60)。

表1 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

討 論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，大量患者通過輸血治療緩解病情、挽救性命，然而，輸血相關(guān)的感染性/非感染性危害(病毒感染、急性肺損傷、溶血反應(yīng)和敗血癥)一直困擾著臨床輸血工作［2，3］。因此輸血安全是輸血醫(yī)學(xué)的基石，也是當(dāng)前全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)問題。輸血安全要做到以下4點(diǎn):①保證獻(xiàn)血者的安全;②杜絕輸血傳播疾病的發(fā)生;③保證輸血操作準(zhǔn)確無誤;④減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生。其中杜絕經(jīng)血液傳播疾病，做好無償獻(xiàn)血的檢測工作，是保證血液質(zhì)量及輸血安全的關(guān)鍵。

雖然血液篩查已極大地降低了輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但由于“窗口期”的存在，早期感染會(huì)出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象，而單純依靠感染恢復(fù)后的抗體又可能出現(xiàn)陽性誤判。病毒效價(jià)、免疫沉默性感染、病毒變異以及難以最終消除“窗口期”等因素的存在，輸血相關(guān)傳染病還是時(shí)有發(fā)生［4］?？乖瓩z測能直觀、準(zhǔn)確的檢出病原體的感染，HBsAg在輸血后50～60天首先被檢測到，可以縮短病原檢測的“窗口期”。在檢測出HBsAg的前幾周，血清中可檢測到低水平病毒;在血清陽轉(zhuǎn)前，HBV DNA增長速度慢于 HCV和HIV，HBV感染的窗口期，由于HBV DNA水平相對較低(平均＜1000拷貝/毫升，范圍1～2400拷貝/毫升)，核酸檢測技術(shù)僅能檢出小部分假陰性獻(xiàn)血員。雖然核酸檢測技術(shù)是一種核酸檢測的重要方法，其敏感度、特異性均較高，但其檢測儀器、技術(shù)及成本均高，基層單位不能常規(guī)開展該項(xiàng)目［5］。膠體金檢測技術(shù)雖然簡便快捷，但其敏感度低、假陰性率高，而且成本較高，不適宜作為獻(xiàn)血人員HBsAg的初篩方法。

QD具有獨(dú)特的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性，因而受到研究者的重視，目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要用于體內(nèi)成像、藥物緩釋、紅外熱療及固相免疫組化分析等［6～8］。MMS具有磁響應(yīng)性，在磁場中會(huì)產(chǎn)生聚集，將其與相應(yīng)抗原或抗體相連，制作成能捕獲不同目標(biāo)的免疫磁微粒，在磁場的作用下，便能達(dá)到分離結(jié)合被檢物量子點(diǎn)的目的［9］。量子點(diǎn)與磁微粒可連接多種生物活性基團(tuán)，如抗體，通過抗原抗體反應(yīng)即可獲得量子點(diǎn)磁微粒與抗原抗體的復(fù)合物，利用磁微粒的可富集特性，經(jīng)過磁場聚集后放大量子點(diǎn)的熒光信號(hào)，達(dá)到高敏感度檢測目標(biāo)抗原的目的。合理利用量子點(diǎn)與磁微粒的特性，可以不依賴特殊儀器擴(kuò)增標(biāo)本而放大信號(hào)，從而在短時(shí)間內(nèi)高敏感度檢出目標(biāo)抗原。

本研究采用抗HBsAg的異源單克隆抗體分別偶聯(lián)QD、MMS，以雙抗體夾心法結(jié)合待測標(biāo)本中的HB-sAg，利用磁微粒在磁場中的富集特性，在液相中聚集大量抗原，提高了檢測的敏感度，本研究方法對HB-sAg的最低檢出濃度為1ng/ml。此外，由于QD的熒光強(qiáng)度高，光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，熒光淬滅作用小。偶聯(lián)蛋白后的MMS也可冷藏保存，因此，可預(yù)先完成QD及MMS的偶聯(lián)標(biāo)記，然后進(jìn)行處理標(biāo)本及檢測目標(biāo)抗原，大大縮短檢測時(shí)間，檢測時(shí)間約為40min，較ELISA法可縮短2/3時(shí)間。由于本方法是基于量子點(diǎn)熒光信號(hào)直接檢測目標(biāo)抗原，而非檢測吸光度，因而對標(biāo)本的要求較低，不受脂血、溶血、黃疸等因素影響，具備良好的特異性。

以熒光定量PCR方法為參照方法，本方法檢測HBsAg的敏感度、特異性均較高，而且與ELISA法檢測結(jié)果無差異。HBV DNA陽性患者血清中有4例未檢出HBsAg，究其原因可能是機(jī)體產(chǎn)生抗體，清除了HBsAg，HBsAg蛋白變性。HBV DNA陰性患者血清檢有8例檢出HBsAg，原因可能有機(jī)體產(chǎn)生e抗體，病毒被清除，病毒處于非復(fù)制期。本研究建立的方法檢測結(jié)果與ELISA一致，但是檢測速度快，與熒光定量PCR技術(shù)相比，其成本低，操作簡便，對實(shí)驗(yàn)室及從業(yè)人員要求低，可用于獻(xiàn)血、輸血人員HBsAg的篩查。

磁微粒、量子點(diǎn)標(biāo)記抗體直接熒光檢測HBsAg操作簡便、無需特殊儀器，敏感度也較高，在流動(dòng)獻(xiàn)血車及愛心獻(xiàn)血屋的HBsAg人群篩查中有著巨大的潛力和應(yīng)用前景。

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