人牙周膜細(xì)胞復(fù)合殼聚糖－膠原溫敏水凝膠異種移植構(gòu)建可注射骨組織的研究

李 穎 楊亞冬 谷子芽 楊 悅 傅 婷 張文元

牙周病是一種慢性骨破壞性疾病，尤其是牙槽骨的破壞和喪失可導(dǎo)致牙齒脫落，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。重建牙槽骨是治療的關(guān)鍵，近年來組織工程研究為牙周再生治療提供了新的希望。支架材料和種子細(xì)胞都是組織工程成功應(yīng)用的重要因素。以凝膠材料為支架的可注射系統(tǒng)是組織工程的一種新的研究方向［1］。凝膠材料在體外為液態(tài)，進(jìn)入體內(nèi)可快速膠化，具有微創(chuàng)、操作簡便，植入細(xì)胞分布均勻的優(yōu)勢。此外，凝膠材料具有流動性，可充盈至整個缺損區(qū)域，特別對不規(guī)則形狀部位，如牙槽骨的修復(fù)具有重要價值。

殼聚糖是目前常用的一種生物材料。殼聚糖結(jié)合磷酸甘油鈉鹽后具有溫敏性，在室溫下保持液態(tài)，而當(dāng)溫度升高至生理溫度(37℃)時，發(fā)生固化，其特性適合用作可注射凝膠支架［2］。Ⅰ型膠原是天然骨組織胞外基質(zhì)的主要成分，免疫原性低，生物相容性好，能促進(jìn)成骨礦化和新骨組織的形成［3］。構(gòu)建殼聚糖－膠原水凝膠可進(jìn)一步提高殼聚糖凝膠支架的生物親和力，并有效解決純膠原支架在體內(nèi)吸收降解過快的問題。本研究從人牙周膜組織中分離得到間充質(zhì)樣牙周膜細(xì)胞(periodontal pigament cells，PDLCs)成骨誘導(dǎo)預(yù)處理后，復(fù)合殼聚糖－膠原水凝膠異種移植于小鼠皮下，觀察組織的再生，為構(gòu)建可注射骨組織治療骨缺損打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1．材料:高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(四季青)，青－鏈霉素100×母液(Gibco)，Ⅰ型膠原酶(Gibco)，Dispase酶(Roche)，磷酸鹽緩沖液(phosphate－buffered saline，PBS)，殼聚糖(上海博奧公司)，地塞米松，β－磷酸甘油鈉，維生素C(美國Sigma公司)，Ⅰ型鼠尾膠原溶液(5mg/ml，杭州生友公司)，Live/Dead細(xì)胞活力染色試劑盒(Invitrogen公司)。ICR小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。

2．PDLC的分離培養(yǎng):取口腔門診因正畸需要拔除的健康雙尖牙或第3磨牙(患者年齡20～30歲，知情并同意)，用PBS以從牙根到牙冠的方向沖洗牙體，徹底清除血污。刮取根中下1/3段的牙周膜組織，加入3mg/ml膠原酶和4mg/ml Dispase酶1∶1混合消化液，37℃下消化60min后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中和。細(xì)胞培養(yǎng)液為添加10%胎牛血清和1%青－鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。離心收集消化后的細(xì)胞和組織塊，加入培養(yǎng)液懸浮后，轉(zhuǎn)入35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

3．殼聚糖 －膠原溫敏水凝膠的制備:將殼聚糖溶于0.1mol/L的鹽酸，配制2%殼聚糖溶液。攪拌至完全溶解，紗布過濾后，高壓蒸汽滅菌(121℃，15min)，4℃保存。用雙蒸水配制50% β－磷酸甘油鈉，抽濾滅菌。首先，將殼聚糖溶液和Ⅰ型膠原溶液以2∶1(v/v)混合后置于冰浴中，逐滴加入預(yù)冷的β－磷酸甘油鈉溶液，使其終濃度達(dá)到6%。殼聚糖－膠原－β－磷酸甘油鈉溶液在低溫下可保持液態(tài)，當(dāng)置于37℃環(huán)境下，可發(fā)生固化成為凝膠，以下簡稱為殼聚糖－膠原水凝膠。

4．PDLCs在凝膠中三維培養(yǎng)的活/死染色:將PDLCs細(xì)胞以5×104個/毫升懸浮于液態(tài)的水凝膠中，接種入24孔板，每孔300μl。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，凝膠固化后，補入500μl細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞三維培養(yǎng)第3天時，進(jìn)行活/死細(xì)胞染色。按Live/Dead染色試劑盒說明書，加入CalceinAM、PI染料，激光共聚焦顯微鏡下觀察。綠色為活細(xì)胞，而紅色為死細(xì)胞。

5．動物移植實驗:將單層培養(yǎng)80%匯合的PDLCs細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)液(即添加10nmol/L地塞米松、10mmol/L β－磷酸甘油鈉和80μg/ml維生素C的細(xì)胞培養(yǎng)液)預(yù)處理1周后，消化為單個細(xì)胞。以1×106個/毫升懸浮于液態(tài)的水凝膠中，用于動物體內(nèi)移植。取5周齡ICR小鼠共3只，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，背部脫毛后消毒。(1)實驗組:把含PDLCs細(xì)胞的凝膠溶液注射入小鼠背部皮下右側(cè)，每個位點500μl。(2)對照組:同一小鼠背部皮下左側(cè)僅注射等量不含細(xì)胞的凝膠溶液。

6．組織化學(xué)染色:細(xì)胞－凝膠復(fù)合物皮下移植6周后，過麻醉處死小鼠。取出皮下移植物，10%甲醛溶液固定后，脫水，蠟塊包埋，切片(4μm)，并進(jìn)行蘇木精－伊紅染色(hematoxylin－eosin staining，HE)和Masson染色。

結(jié) 果

1．殼聚糖－膠原溫敏水凝膠的性狀:殼聚糖－膠原－β－磷酸甘油鈉溶液在室溫下呈液態(tài)，透明度較好并具有流動性(圖1A)。37℃孵育后，20min之內(nèi)固化，失去流動性，呈灰白色凝膠狀(圖1B)。因此，殼聚糖－膠原水凝膠具有溫敏性。

圖1 殼聚糖－膠原水凝膠的性狀

2．牙周膜細(xì)胞的形態(tài):經(jīng)酶消化后的牙周膜組織在貼壁3～5天后，有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。生長迅速，15天左右可達(dá)到匯合。經(jīng)2～3次消化傳代，細(xì)胞呈均一的成纖維樣形態(tài)，即PDLCs(圖2)，本研究中所用細(xì)胞為P5代以內(nèi)。

圖2 原代培養(yǎng)PDLCs細(xì)胞從組織塊中爬出

3．牙周膜細(xì)胞在殼聚糖－膠原溫敏水凝膠中的三維培養(yǎng):單層培養(yǎng)的PDLCs呈成纖維樣形態(tài)，但在三維培養(yǎng)條件下，PDLCs呈球形均勻分布于凝膠中?；?死細(xì)胞染色實驗說明，＞90%的細(xì)胞可在凝膠中存活(圖3)，殼聚糖－膠原水凝膠細(xì)胞毒性較小。

4．細(xì)胞－凝膠復(fù)合物異種移植后的體內(nèi)組織再生:細(xì)胞－凝膠復(fù)合物以及純凝膠支架注射植入ICR小鼠皮下都可形成包塊。6周后，包塊仍然位于皮下原位成膠處(圖4A)。包塊周圍無化膿、水腫、壞死等反應(yīng)(圖4B、C)。分離植入物后，大體觀察發(fā)現(xiàn)，實驗組植入物外觀呈淡紅色，血管化明顯(圖4D)，而對照組植入物呈淡黃色，沒有明顯血管張入(圖4E)。

圖3 大多PDLCs在固化殼聚糖－膠原水凝膠中三維培養(yǎng)中存活

圖4 殼聚糖－膠原水凝膠復(fù)合成骨預(yù)處理的PDLCs后，植入ICR小鼠皮下的大體外觀

HE染色結(jié)果顯示:實驗組與對照組植入塊周圍都形成明顯纖維細(xì)胞增生包裹支架。實驗組支架內(nèi)結(jié)締組織生成量明顯高于對照組，有致密膠原纖維生成，伴隨新生毛細(xì)血管。對照組僅支架外圍有少量疏松纖維組織形成。材料支架伊紅染色強陽性，新生膠原纖維組織中可見未完全降解的材料顆粒(圖5)。Masson染色結(jié)果與HE染色結(jié)果相似:對照組僅支架外圍有少量纖維組織陽染，實驗組支架中膠原纖維生成量明顯高于對照組，支架內(nèi)有大量致密膠原纖維生成(圖6)。

圖5 植入物HE染色組織學(xué)觀察

圖6 植入物Masson染色組織學(xué)觀察

討 論

可注射骨組織工程的研究為臨床骨損傷的治療和修復(fù)提供了一種新的方式。殼聚糖材料來源天然廣泛，成本低廉，具有良好的生物相容性和抗菌性，是常用的支架材料之一，膠原則進(jìn)一步增加材料的骨相容性［2］。殼聚糖 －膠原溫敏水凝膠在體內(nèi)迅速固化，操作方便，可能是理想的可注射支架材料。牙周膜細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特性，增殖能力更強，可參與體內(nèi)牙槽骨的再生，易于成骨分化，因此是骨組織工程理想的“種子細(xì)胞”之一［4］。本實驗結(jié)合兩者構(gòu)建牙周膜細(xì)胞－殼聚糖膠原溫敏水凝膠的可注射骨組織，觀察皮下植入后的組織再生，為臨床可注射骨組織的開發(fā)應(yīng)用提供有價值的資料。

殼聚糖－膠原溫敏水凝膠作為可注射支架材料，在組織工程應(yīng)用中已有報道。大多研究認(rèn)為:殼聚糖－膠原溫敏水凝膠具有良好的生物相容性，可支持多種細(xì)胞體內(nèi)及體外的三維培養(yǎng)。大多細(xì)胞在凝膠中存活率＞90%，并且可支持細(xì)胞的長期培養(yǎng)與增殖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)作為種子細(xì)胞的應(yīng)用最為多見，BMSC體外預(yù)分化處理后包裹于殼聚糖－膠原水凝膠中可促進(jìn)多種組織的再生，如骨、軟骨組織或髓核的再生［5～8］。其他一些細(xì)胞復(fù)合殼聚糖凝膠的三維培養(yǎng)應(yīng)用也有報道。Lu等［9］發(fā)現(xiàn)殼聚糖溫敏水凝膠復(fù)合胚胎干細(xì)胞后移植心肌梗死動物模型病灶區(qū)，可改善心臟功能。Leipzig等［10］發(fā)現(xiàn)交聯(lián)細(xì)胞因子的殼聚糖凝膠可更有效促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)下生長與定向分化，有望用于神經(jīng)再生的治療。目前，牙周膜細(xì)胞與殼聚糖－膠原溫敏水凝膠相關(guān)生物相容性研究還未見報道。與其他成體組織來源細(xì)胞相比，PDLC細(xì)胞組織來源廣泛、造成創(chuàng)傷微小、倫理爭議小，特別在牙周組織再生擁有良好的應(yīng)用前景［13］。本實驗中，殼聚糖－膠原水凝膠支持PDLCs的三維培養(yǎng)，大部分細(xì)胞可在凝膠支架中存活，與其他細(xì)胞系的實驗結(jié)果相似。殼聚糖中添加膠原成分有利于提高支架的生物相容性，Wang等［12］發(fā)現(xiàn)殼聚糖溫敏水凝膠中膠原成分的添加可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架中的鋪展，使三維培養(yǎng)下的細(xì)胞形態(tài)接近與二維培養(yǎng)。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原具有明顯促進(jìn)細(xì)胞鋪展的作用，牙周膜細(xì)胞在凝膠三維培養(yǎng)下呈球形，而平面培養(yǎng)時細(xì)胞形態(tài)呈紡錘形。這可能與不同研究中，細(xì)胞來源或Ⅰ型膠原的種類不同有關(guān)。

本研究將人牙周膜細(xì)胞復(fù)合殼聚糖－膠原溫敏水凝膠異種移植入ICR小鼠皮下發(fā)現(xiàn)，實驗組植入物內(nèi)血管化以及結(jié)締組織、膠原纖維等軟組織的再生顯著高于對照組。血管化是組織再生成功的一個重要指標(biāo)，新生毛細(xì)血管負(fù)責(zé)營養(yǎng)支架內(nèi)細(xì)胞，保證新生組織的存活和功能［13］。膠原纖維的增生是早期成骨的一個重要指標(biāo)，細(xì)胞合成分泌膠原形成胞外基質(zhì)，構(gòu)成膠原網(wǎng)絡(luò)，再由磷酸鈣以結(jié)晶形式沉積于膠原網(wǎng)架上，形成礦化的基質(zhì)［14］。因此，細(xì)胞－凝膠支架移植組胞外膠原形成明顯增加，可促進(jìn)骨組織再生。目前細(xì)胞移植治療機制仍有存在爭議，植入細(xì)胞本身可能通過增殖和分化重建組織，也有研究認(rèn)為植入細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子，吸引周圍宿主長入支架促進(jìn)組織再生［15］。本研究對PDLCs進(jìn)行了成骨誘導(dǎo)預(yù)處理，可提高其成骨分化率，但宿主細(xì)胞也可能參與了植入物膠原纖維增加和血管化的過程，需要對植入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記示蹤等進(jìn)一步研究了解其機制。

然而，本研究未觀察到成熟的礦化組織的形成。Sun等［7］利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖－膠原凝膠種植動物皮下也觀察到結(jié)締組織等軟組織的形成，但未見硬組織。類似結(jié)果在傳統(tǒng)固體支架的皮下移植如絲素、生物陶瓷、膠原等也有報道。這可能與材料成分骨傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性不強有關(guān)，今后可通過加入具有良好骨傳導(dǎo)性的材料，如羥基磷灰石(HA)來改良。此外，動物皮下移植的宿主環(huán)境本身不利于成骨，而在植入骨缺損部位時，PDLCs也可能通過旁分泌作用，吸引或刺激周圍骨組織生長，從而促進(jìn)骨修復(fù)。

綜上所述，殼聚糖－膠原溫敏水凝膠可支持牙周膜細(xì)胞的三維培養(yǎng)，無細(xì)胞毒性。水凝膠生理溫度下迅速固化，是理想的可注射支架之一。殼聚糖－膠原溫敏水凝膠復(fù)合成骨誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞有望構(gòu)建可注射骨組織，修復(fù)骨缺損。特別是牙槽骨缺損，有望增加牙槽骨骨量，為牙周病治療提供希望，也可提高種植牙成功率。

1 Li Y，Rodrigues J，Tomas H．Injectable and biodegradable hydrogels:gelation，biodegradation and biomedical applications［J］．Chem Soc Rev，2012，41(6):2193－2221

2 Khor E，Lim LY．Implantable applications of chitin and chitosan［J］．Biomaterials，2003，24(13):2339－2349

3 Yang XB，Bhatnagar RS，Li S，et al．Biomimetic collagen scaffolds for human bone cell growth and differentiation ［J］．Tissue Eng，2004，10(7－8):1148－1159

4 Huang GT，Gronthos S，Shi S．Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs．those from other sources:their biology and role in regenerative medicine［J］．J Dent Res，2009，88(9):792－806

5 Hoemann CD，Chenite A，Sun J，et al．Cytocompatible gel formation of chitosan－glycerol phosphate solutions supplemented with hydroxyl ethyl cellulose is due to the presence of glyoxal［J］．J Biomed Mater Res A，2007，83(2):521－529

6 Kim KS，Lee JH，Ahn HH，et al．The osteogenic differentiation of rat muscle－derived stem cells in vivo within in situ－forming chitosan scaffolds［J］．Biomaterials，2008，29(33):4420 －4428

7 Sun B，Ma W，Su F，et al．The osteogenic differentiation of dog bone marrow mesenchymal stem cells in a thermo－sensitive injectable chitosan/collagen/beta－glycerophosphate hydrogel:in vitro and in vivo［J］．J Mater Sci Mater Med，2011，22(9):2111－2118

8 Dang JM，Sun DD，Shin－Ya Y，et al．Temperature－responsive hydroxybutyl chitosan for the culture of mesenchymal stem cells and intervertebral disk cells［J］．Biomaterials，2006，27(3):406 －418 9 Lu WN，Lu SH，Wang HB，et al．Functional improvement of infarcted heart by co－injection of embryonic stem cells with temperatureresponsive chitosan hydrogel［J］．Tissue Engineering，Part A，2009，15(6):1437－1447

10 Leipzig ND，Wylie RG，Kim H，et al．Differentiation of neural stem cells in three－dimensional growth factor－immobilized chitosan hydrogel scaffolds［J］．Biomaterials，2011，32(1):57 －64

11 Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al．Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament［J］．Lancet，2004，364(9429):149－155

12 Wang L，Stegemann JP．Thermogelling chitosan and collagen composite hydrogels initiated with beta－glycerophosphate for bone tissue engineering［J］．Biomaterials，2010，31(14):3976－3985

13 Novosel EC，Kleinhans C，Kluger PJ．Vascularization is the key challenge in tissue engineering［J］．Adv Drug Deliv Rev，2011，63(4 －5):300－311

14 Dimitriou R，Jones E，McGonagle D，et al．Bone regeneration:current concepts and future directions［J］．BMC Med，2011，9:66

15 Ishizaka R，Hayashi Y，Iohara K，et al．Stimulation of angiogenesis，neurogenesis and regeneration by side population cells from dental pulp［J］．Biomaterials，2013，34(8):1888 －1897