線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的研究及體會

張亞敏 徐 虹 孫 華 陳素輝 王富明

缺血性腦血管疾病的高發(fā)生率、高致殘率嚴(yán)重威脅人類生命健康，建立穩(wěn)定性強、可重復(fù)性高的缺血性腦卒中動物模型是研究急性腦缺血后腦組織損傷的生理病理變化的基礎(chǔ)。Longa等［1］以改良線栓法制備了大鼠中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，隨后該模型便被廣泛應(yīng)用于腦梗死的研究［2，3］。但MCAO模型制作過程中，易受到多種因素的影響，各個實驗室的條件不一，導(dǎo)致腦缺血面積的不穩(wěn)定及大鼠高死亡率等問題，無法保障后續(xù)實驗的順利進(jìn)行［4］。本課題組通過固定線栓，控制大鼠體重，以改良的Longa法制作MCAO模型，2h后拔出線栓再灌注，并總結(jié)了特定型號的栓線適合的大鼠體重范圍。

材料與方法

1．實驗動物及實驗用品:(1)實驗動物:SPF級健康雄性SD大鼠，體重230～270g，北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心提供。實驗動物許可證號:SCXK(京)2012－0001。(2)飼養(yǎng)條件:室溫25 ±1℃，5 只/籠，光照∶黑暗 =12h∶12h，濕度 75%，大鼠術(shù)前自由飲水和攝食。(3)實驗用品:水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5－Triphenyltetrazolium chloride，TTC，Sigma，美國);自制大鼠固定板;尼龍線栓(2636－4A，北京沙東生物技術(shù)有限公司)，大鼠腦槽(中科院藥植所);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP－9160，上海一恒科技有限公司)。

2．分組與模型制作方法:采用數(shù)字表法將動物隨機分為兩組，組1體重控制為230～249g;組2體重控制為250～269g，每組10只。MCAO模型制作在北京協(xié)和醫(yī)院SPF級實驗動物操作中心完成，參考Longa等［1］的線栓法。術(shù)前大鼠禁食12h，腹腔注射10%的水合氯醛(0．35ml/100g)麻醉后固定。常規(guī)消毒手術(shù)視野區(qū)皮膚，切開頸部正中皮膚約2～3cm，鈍性分離頸部肌肉和結(jié)締組織，從胸鎖乳突肌和頸前肌群之間向深部分離，顯露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)，充分暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)。5－0 號手術(shù)線結(jié)扎ECA根部和CCA分叉處1cm處，CCA掛線但不結(jié)扎，ECA距離CCA分叉處約5mm處剪口，使線栓由小口經(jīng)ECA進(jìn)入CCA，剪斷ECA，線栓進(jìn)入約5mm時調(diào)整栓線方向和弧度，避開翼腭動脈(pterygopalatine artery，PA)的開口處，使栓線沿ICA緩慢插入，遇一定阻力后停止進(jìn)栓，以使線栓完全閉阻右側(cè)大腦中動脈入口，線栓插入長度約為18．0±0.5mm。雙線結(jié)扎CCA剪口上方絲線，外留長約1cm左右的線栓后縫合，將大鼠置于籠內(nèi)。腦缺血2h后拔出線栓實現(xiàn)再灌注，再灌注前以10%的水合氯醛(0．25ml/100g)腹腔注射麻醉動物(減少麻藥用量，防止動物因麻藥過量死亡)，緩慢地拉出線栓，當(dāng)看到栓線的黑色標(biāo)記后剪掉栓線。大鼠清醒后自由接觸食物和水。

3．神經(jīng)功能評分:缺血2h大鼠清醒后參照Bederson等［5］的5級分類法對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行盲評:0級:無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀;1級:提尾，左前肢屈曲，不能完全伸展;2級:提尾，左前肢屈曲，置于地面向左側(cè)推動，爬行阻力較右側(cè)下降;3級:在2級基礎(chǔ)上爬行時不自主向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4級:意識不清，包括24h內(nèi)死亡。

4．腦梗死體積測定:兩組大鼠MCAO術(shù)后24h，腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g)深度麻醉大鼠，快速于冰上斷頭取腦置于平皿中，－20℃速凍10min，待其變硬后取出置于腦槽中，去除額級，冠狀位切成2mm厚的腦片，取前6塊放入0.1%TTC溶液中避光37℃孵育30min，每5min翻動1次使其均勻著色，正常組織染為紅色，腦梗死區(qū)不著色(蒼白色)。4%多聚甲醛固定1h后拍照采圖，Image J軟件分析并計算梗死體積。為了避免因患側(cè)腦水腫引起的計算誤差，采用以下公式計算:右側(cè)梗死面積=左側(cè)腦組織總面積－右側(cè)正常腦組織面積;相對梗死體積=累積右側(cè)梗死面積/累積正常側(cè)腦組織面積 ×100%［6］。

5．統(tǒng)計學(xué)方法:數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件包，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用兩獨立樣本t檢驗進(jìn)行兩組均數(shù)比較和方差齊性檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．兩組大鼠存活情況比較:腦缺血術(shù)后24h觀察兩組大鼠的一般情況，從表1中可以看出組1和組2的死亡率均為10%，無統(tǒng)計學(xué)差異。兩只死亡大鼠的體重分別為232g和252g，通過尸檢發(fā)現(xiàn)，組1中死亡大鼠右側(cè)腦水腫明顯，蛛網(wǎng)膜下腔無出血，推測死亡原因為腦梗急性期腦水腫導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，腦疝死亡;組2死亡大鼠取腦未發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血及明顯腦水腫，可能死因與麻醉藥不耐受、窒息等因素相關(guān)。

2．神經(jīng)功能評分:術(shù)后2h對兩組大鼠行神經(jīng)功能評分，方差齊性檢驗示數(shù)據(jù)不滿足方差齊性(F=15．825，P=0．001 ＜0．05)，選用校正 t檢驗統(tǒng)計分析。組1神經(jīng)功能評分的均值為3．00±0．47，組2為1．80±1．32，差異具有顯著性(P ＜0．05)，且組 2 的標(biāo)準(zhǔn)差較大，神經(jīng)功能評分值離散程度高，大鼠個體之間的神經(jīng)功能評分的差異較大，不穩(wěn)定;組1中除1只死亡外，評分較一致，比較穩(wěn)定(圖1)。

3．腦梗死體積:組1大鼠取腦時右側(cè)腦組織明顯腫脹，右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)的外側(cè)額、頂、顳部區(qū)域顏色蒼白，淺于左側(cè)正常組織，TTC染色可見大腦皮質(zhì)和紋狀體部明顯白色梗死灶;組2外觀腦腫脹不明顯，TTC染色示梗死灶多局限于紋狀體或無梗死灶(圖2)。兩組大鼠平均相對腦梗體積分別為23%、8%。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05，圖3)。

圖1 腦缺血2h后各個大鼠的神經(jīng)功能評分情況

圖2 兩組大鼠缺血再灌注24h后TTC染色情況

圖3 腦缺血再灌注24h后兩組大鼠的腦相對梗死體積比較

討 論

缺血性腦血管病以大腦中動脈供血區(qū)的血流阻塞最為常見，大鼠線栓法制備MCAO模型具有不開顱、損傷小，能準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時間，梗死效果確切等特點，成為研究缺血性腦血管病的病理生理機制的主要動物模型。1986年，Koizumi等［7］首次不開顱經(jīng)CCA栓入尼龍線閉塞大腦中動脈獲得成功，后Longa等［1］于1989年對其進(jìn)行了改進(jìn)后，推廣此方法廣泛應(yīng)用于實驗性腦缺血的研究。Longa等［1］在實驗中采用的是4-0的單股尼龍手術(shù)線，把栓線頭端燒成球形，因其來源困難，各個實驗室常以同等直徑的魚線或尼龍線替代，由于制作工藝不一所致栓線頭端粗細(xì)不定，加之動物的品系，體重及插入深度的不同，而導(dǎo)致實驗性腦缺血灶的不穩(wěn)定。

本課題組在實驗過程中購入線長40mm，線身直徑0．26mm，頭端直徑0．36mm并以多聚賴氨酸包被，在19mm處標(biāo)記黑點的消毒處理后的即用型尼龍栓線，根據(jù)使用說明適用于250～280g大鼠。但是在預(yù)實驗階段控制大鼠體重范圍260～270g，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型成功率較低。推測原因可能與大鼠品系和造模方法有關(guān)。隨后根據(jù)說明書調(diào)整，將大鼠體重降低10～20g，并分組造模，觀察此型號栓線適應(yīng)的大鼠體重。本研究發(fā)現(xiàn)體重范圍在238±6g(230～249g)的SD大鼠用此栓線能得到穩(wěn)定的MCAO模型，缺血2h再灌注24h后TTC染色顯示梗死灶明顯，神經(jīng)功能評分較一致且大鼠的死亡率較低(10%)。

另外，實驗過程中發(fā)現(xiàn)，會遇到以下問題:(1)麻醉死亡或不完全:腹腔注射水合氯醛時誤將麻藥注入股靜脈、膀胱、腸腔或皮下，會導(dǎo)致麻醉死亡或不完全，將注射器刺入腹腔后，輕微回抽，無血無水阻力較小時再推進(jìn)麻藥，麻醉不全時可少量補加麻醉藥(約0.2ml)，減少因麻醉所致的死亡。(2)是否分離PA:PA位置較深，分離PA時對周圍的組織和神經(jīng)損傷較大，引發(fā)大鼠較劇烈的刺激反應(yīng)，耗時較長，故造模過程中不分離PA，可通過手法調(diào)整避開PA，將模型制備時間控制在15min左右。(3)栓線在閉塞大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)之前卡住:有兩種情況可以考慮，一為栓線頭部進(jìn)入PA，此時栓線插入深度約8mm，強行用力繼續(xù)易導(dǎo)致PA破裂，PA位置較深，出血難以止血導(dǎo)致大鼠死亡，可通過調(diào)整栓線方向和弧度，避開PA繼續(xù)向前。二為栓線頭部卡在ICA入顱處，此時栓線進(jìn)入約13mm，此情況較為少見，排除大鼠血管痙攣及調(diào)整栓線方向均阻力較大，若確保栓線不在PA，可酌情放棄手術(shù)，剔除該大鼠。(4)栓線插入深度:栓線進(jìn)入約18mm即可達(dá)到MCA入口，即可感覺有輕微阻力，不可忽略此阻力繼續(xù)推送，研究結(jié)果顯示，栓線插入過深可進(jìn)入MCA使其徹底閉塞，導(dǎo)致腦梗死面積范圍過大或血管壁破裂，導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，死亡率增加［6］。(5)栓線固定及拔出:栓線到達(dá)指定位置后由雙線固定且須松緊適度，太松大鼠清醒后易自行拔出引發(fā)ECA斷端出血形成血腫，太緊拔線栓時須二次打開傷口解開固定線拔栓線。大鼠清醒狀態(tài)下拔栓線易引起其劇烈掙扎，栓線易刺破血管膜引發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血，或栓線全部拔出致血液經(jīng)ECA斷端流出，故麻醉后拔出栓線為佳。

通過實驗研究筆者發(fā)現(xiàn)MCAO模型的成功制作與多種因素相關(guān)，最關(guān)鍵因素在于大鼠體重和選擇的所用栓線的規(guī)格的匹配。故筆者在實驗中選擇購于公司的規(guī)格一致的栓線，以排除人工制作栓線引起的實驗誤差。本研究結(jié)果顯示，體重范圍在238±6g的SD大鼠采用沙東2636－4A型號的栓線可得到穩(wěn)定的，可重復(fù)的MCAO模型，穩(wěn)定的動物模型是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)，才能使基于該模型展開的實驗研究所得出的實驗結(jié)果真實可信。

1 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84－91

2 Liu X，Wang Z，Wang P，et al．Green tea polyphenols alleviate early BBB damage during experimental focal cerebral ischemia through regulating tight junctions and PKCalpha signaling［J］．BMC Complement Altern Med，2013，13(1):187

3 Jokivarsi KT，Liimatainen T，Kauppinen RA，et al．Relaxation along a fictitious field(RAFF)and Z－spectroscopy using alternating－phase irradiation(ZAPI)in permanent focal cerebral ischemia in rat［J］．PLoS One，2013，8(7):e69157

4 Belayev L，Busto R，Zhao W，et al．HU －211，a novel noncompetitive N －methyl－D－aspartate antagonist，improves neurological deficit and reduces infarct volume after reversible focal cerebral ischemia in the rat［J］．Stroke，1995，26(12):2313 －2319，2319 －2320

5 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al．Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］．Stroke，1986，17(3):472 －476

6 包新杰，趙浩，趙英杰，等．線栓法插線深度對大鼠腦梗死模型制備的影響［J］．中國實驗動物學(xué)報，2011，19(3):233－236

7 Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T．Experimental studies of ischemic brain edema:1．A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］．Stroke，1986，8(5):1－8