天山雪蓮細胞培養(yǎng)物多糖對免疫介導的再生障礙性貧血模型小鼠的治療作用研究

袁紹鵬 陳日道 史 記 白金葉 玄玲玲 戴均貴 侯 琦

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA，以下簡稱再障)是由多種原因引起的造血干細胞數(shù)量下降，功能異常，從而導致機體血細胞減少的一種病癥［1，2］。目前的臨床和分子機制研究表明，AA發(fā)病機制除與造血干細胞自身缺陷、造血組織微環(huán)境損傷有關外，免疫系統(tǒng)失調在AA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，多種免疫細胞和炎癥因子參與調控AA的發(fā)病機制［3，4］。T細胞分化和亞群異常、炎癥因子調控失常、Fas/FasL系統(tǒng)和活化T細胞介導的細胞凋亡、免疫遺傳因素等免疫機制紊亂，最終引起造血干/祖細胞的減少和(或)缺陷，從而引發(fā)造血衰竭［5］。CD34蛋白屬于黏附分子中的黏蛋白樣家族，存在于造血干細胞和原始細胞表面，被視為骨髓造血干細胞標志之一，可調控早期造血［6］。與正常骨髓CD34+細胞相比，AA患者的CD34+細胞凋亡比例高于正常人，因此，抑制CD34+細胞凋亡，促進其數(shù)量增加及活化將在AA的治療中發(fā)揮重要的功能［7］。

天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar．et Kir．)為菊科風毛菊屬植物，主產于新疆、西藏等地，民間多用于風濕性關節(jié)炎、散熱除濕、活血通絡、抗疲勞等癥的治療。野生天山雪蓮次生代謝產物成分復雜，具有藥理活性的化合物主要集中在黃酮、生物堿和多糖類［8］。由于野生雪蓮生境特異，生長緩慢，人工栽培困難，加上長期以來對雪蓮的掠奪性采挖，造成野生資源的嚴重匱乏，近年來，國內外的研究人員開展了植物組織細胞培養(yǎng)等研究工作［9］。藥理研究表明，天山雪蓮培養(yǎng)物與野生天山雪蓮具有同樣的抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。既往研究多關注野生天山雪蓮以及天山雪蓮培養(yǎng)物的免疫調節(jié)、鎮(zhèn)痛等功能，但對其治療再生障礙性貧血等活性，特別是天山雪蓮培養(yǎng)物的多糖成分對再生障礙性貧血作用甚少報道。本實驗主要研究及觀察天山雪蓮細胞培養(yǎng)物多糖對輻射免疫介導的再生障礙性貧血模型小鼠的治療作用，對模型小鼠的免疫功能及造血功能進行初步研究，旨在探討雪蓮多糖提取物治療再障的療效。

材料與方法

1．實驗動物:DBA/2小鼠，20 ～22g，雄性，SPF 級，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供［實驗動物合格證:SCXK－(京)2009－0007］。BALB/c小鼠，20～22g，雄性，SPF 級，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供［實驗動物合格證:SCXK －(京)2009－0007］。

2．試劑和實驗設備:天山雪蓮細胞培養(yǎng)物多糖(簡稱XL)，由本所戴均貴研究員課題組提供。天山雪蓮細胞培養(yǎng):細胞培養(yǎng)采用附加30g/L sucrose，0．5mg/L NAA(α－naphthalene acetic acid)，0．5mg/L 6 － BA(6 － benzyl aminopurine)，0.2mg/L 2，4－D(2，4－dichlorophenoxyacetic acid)的 MS培養(yǎng)基，于黑暗下?lián)u床旋轉振蕩培養(yǎng)，搖床轉速為110r/min，培養(yǎng)溫度為25±1℃。多糖的制備:稱取天山雪蓮干燥細胞培養(yǎng)物，95%乙醇回流脫脂，揮干溶劑，采用10倍水85℃浸提3次，每次2h，減壓過濾，合并濾液，減壓濃縮，加入無水乙醇至醇濃度為80% 沉淀多糖，4℃靜置24 h，減壓過濾沉淀，無水乙醇洗滌，低溫干燥后得到雪蓮粗多糖。陽性對照藥:再造生血片(簡稱生血片)，生藥含量 0．7克/片，國藥準字Z22025856，由遼源譽隆亞東藥業(yè)有限責任公司生產，批號:110101。Co60輻照裝置(北大輻射中心);血細胞分析儀(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所安評中心)。

3．動物模型建立方法:(1)動物分組:對照組進行假照射，AA模型組和給藥組按照模型制備方法造模，給藥后每周稱重1次。BALB/c小鼠，隨機分為4組:①正常對照組(Control組)，20只;②模型對照組 (Model組)，20只;③再造生血片組(中藥對照組)，20只;④XL組，20只。(2)AA動物模型制備:①胸腺細胞混懸液的制備:DBA/2小鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡消毒后，在超凈臺中無菌取出胸腺，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，除去黏附的結締組織、剪碎、輕磨、200目不銹鋼網過濾，制成單細胞懸液，臺盼藍鑒定細胞活性(95%以上)，計數(shù)后用RPMI 1640培養(yǎng)液調細胞濃度為5×106cell/ml，置CO2孵箱中待用;②Co60γ射線的照射:BALB/c小鼠，給予4．0Gy劑量Co60源γ射線全身照射。另取BALB/c小鼠，進行假照射，為 Control組;③小鼠尾靜脈注射胸腺細胞混懸液:BALB/c小鼠于射線照射后的當天，由尾靜脈注射上述新鮮配制的胸腺細胞懸液0.2毫升/只，含細胞數(shù)為1×106。

4．給藥方式和初始劑量:各組動物分別于造模當日開始灌胃給藥，每天灌胃2次，連續(xù)給藥14天。各組每次給藥劑量依次為:再造生血片組3．8g/kg;XL組500mg/kg。

5．指標檢測:(1)外周血常規(guī)指標測定:小鼠于末次給藥30min后，眼眶取血約0．2ml，置抗凝管中，混勻，在血細胞分析儀上進行血常規(guī)測定，包括紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、網址紅細胞百分比等。(2)骨髓免疫學和病理分析:小鼠斷頸處死，取出右側股骨，置冰上，按統(tǒng)一尺度截取股骨干部分(去除兩端)，用800μl胎牛血清沖出全部骨髓，離心后重懸，吸取500μl骨髓細胞懸液，以FITC標記的抗小鼠CD34單克隆抗體標記細胞，進行 FACS檢測，檢測細胞膜CD34表達及熒光信號強度。各組股骨標本經10%甲醛固定，5% 硝酸脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，HE染色，光鏡檢查并拍照。(3)動物臟器指數(shù)測定:處死小鼠后，對小鼠的體重、脾臟和胸腺進行稱重，計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

結 果

1．動物體重、脾臟及胸腺指數(shù)的變化:各組動物體重、脾臟及胸腺指數(shù)的變化相比見表1。與對照組相比，AA模型組的體重、脾臟和胸腺指數(shù)均明顯降低。與模型組相比，XL組給藥后，明顯促進小鼠脾臟指數(shù)(P ＜0．05)。

表1 小鼠體重、脾臟及胸腺指數(shù)(±s，n=20)

表1 小鼠體重、脾臟及胸腺指數(shù)(±s，n=20)

與對照組相比，*P ＜0．001;與 AA模型組相比，#P ＜0．05

組別 體重(g) 脾臟指數(shù)(mg/10g體重)胸腺指數(shù)(mg/10g體重)對照組20．014 ±1．096 34．923 ±3．586 17．093 ±2．925 AA 模型組 18．767 ±1．302 29．180 ±5．732* 12．39 ±2．802*生血片組 19．344 ±1．077 31．599 ±5．912 14．524 ±3．234#雪蓮多糖組 18．833 ±1．733 34．173 ±11．385#11．608 ±3．097

2．血常規(guī)細胞分類計數(shù)測定:與正常對照組相比，Co60輻照兼免疫介導的再生障礙性貧血模型組與對照組相比，紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)(P＜0．001)和網織紅細胞百分比明顯降低(P＜0．05)，各組數(shù)據比較有統(tǒng)計學差異。與之相比，生血片和XL明顯促進了血液中紅細胞和血紅蛋白含量，有統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 小鼠外周血常規(guī)及網織紅細胞計數(shù)(±s，n=20)

表2 小鼠外周血常規(guī)及網織紅細胞計數(shù)(±s，n=20)

與對照組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．001;與 AA 模型組相比;#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 WBC(109/L) RBC(1012/L) HGB(g/L) PLT(109/L)RET%對照組 8．5 ±2．8 10．8 ±0．3 170．3 ±4．7 728．1 ±135．9 2．7 ±0．5 AA 模型組 2．6 ±1．8＊＊ 8．5 ±0．7＊＊ 137．7 ±10．3＊＊ 558．4 ±149．7＊＊ 3．6 ±1．6*生血片組 2．4 ±1．7 9．0 ±0．4## 147．1 ±7．1## 679．0 ±258．3# 3．7 ±0．9雪蓮多糖組 2．2 ±1．6# 9．0 ±0．5## 146．9 ±11．1#508．7 ±143．9 3．0 ±1．4

3．骨髓造血祖細胞檢測結果:為進一步證明XL多糖提取物對小鼠骨髓造血功能的改善活性，筆者提取小鼠骨髓細胞，對骨髓的造血祖細胞生物標志物CD34的表達進行了流式檢測。實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組CD34+陽性細胞所占比率降低，且細胞數(shù)明顯減少。給予藥物治療后，多糖提取物以及陽性藥再造生血片均提高了CD34+造血祖細胞在骨髓總細胞中所占的比率 (圖1)，以及CD34+陽性造血細胞數(shù)目(圖2)。

圖1 小鼠骨髓細胞CD34+流式檢測

4．病理分析結果:骨髓病理學檢查結果顯示，4Gy輻射照射可誘發(fā)小鼠骨髓造血功能病理學改變，表現(xiàn)為骨髓空虛，造血組織不同程度減少，可見廣泛脂肪細胞浸潤，白系細胞明顯減少，骨髓紅/白細胞比例失調。骨髓血竇明顯擴張、充血和片狀出血。與模型組相比，XL多糖治療組和再造生血片組可不同程度減輕輻射照射誘發(fā)小鼠骨髓造血功能病理學改變，其病理學結果見圖3。

圖2 小鼠骨髓CD34+陽性造血細胞統(tǒng)計

圖3 小鼠骨髓病理學觀察結果(HE，×100)

討 論

再生障礙性貧血是一組以造血組織功能衰竭為特征的綜合征，對外周血常規(guī)檢測和骨髓病理分析是從動物模型進行評價的基本方法［4］。本次實驗中，與正常對照組相比，Co60輻照兼免疫介導的再生障礙性貧血模型組與對照組間血常規(guī)紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)和網織紅細胞百分比等各組數(shù)據有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，說明筆者成功建立了小鼠再生障礙性貧血模型。在外周血常規(guī)測定結果中，陽性對照藥再造生血片(7g/kg)在給藥14天后，血常規(guī)紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)、網織紅細胞計數(shù)等各組數(shù)據有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，網織紅細胞百分比相對模型也有所提高，證明再造生血片的治療活性在本次實驗中得到驗證。雪蓮多糖(XL)在給藥14天后，與AA模型組相比，紅細胞計數(shù)和血紅蛋白含量有比較明顯的提升，且與模型組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，以上結果提示化合物對該模型治療有一定的改善活性。

為進一步證明雪蓮多糖提取物對小鼠骨髓造血功能改善的活性，筆者對骨髓的造血祖細胞及其生物標志物CD34的表達進行了流式檢測。CD34分子是高度糖基化的跨膜糖蛋白，其選擇性地表達于人類及其他哺乳動物造血祖細胞表面，并隨細胞的成熟逐漸減弱至消失［10］。實驗觀察到模型組與正常對照組相比，CD34+細胞所占比率降低且細胞數(shù)明顯減少，證明輻射對于小鼠骨髓祖細胞具有明顯的破壞作用。給予受試化合物治療后，無論是對照藥物再造生血片，還是受試藥物雪蓮多糖均可促進CD34+細胞在骨髓總細胞中所占比率，這一結果初步證明雪蓮多糖對CD34+造血祖細胞的成熟與分化具有較明顯的活性。

小鼠骨髓病理學檢查結果顯示，4Gy輻射照射可誘發(fā)小鼠骨髓造血功能病理學改變，表現(xiàn)為骨髓空虛，造血組織不同程度減少，可見廣泛脂肪細胞浸潤，骨髓紅/白細胞比例失調。骨髓血竇明顯擴張、充血和片狀出血，相對于模型組，雪蓮多糖和陽性藥生血組可不同程度減輕輻射照射誘發(fā)小鼠骨髓造血功能病理學改變。這一結果與李永萍等［11］報道再生障礙性貧血患者經免疫抑制劑環(huán)孢素A治療前后骨髓活檢的病理改變情況相近，證明雪蓮多糖提取物多糖對再生障礙性貧血小鼠模型有治療活性。

綜合以上實驗結果，筆者的研究成功構建了輻射免疫介導的再生障礙性貧血的小鼠模型，并且初步評價了雪蓮多糖提取物多糖對于該模型的治療效果。筆者的結果證明雪蓮多糖對于治療輻射免疫介導的再生障礙性貧血小鼠具有較明顯的治療改善活性，后續(xù)實驗有待進一步研究探索藥物劑量與藥效及藥物的安全性之間的關系。

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