NF－κB和AQP－4在亞低溫治療大鼠腦出血中的作用

藍(lán)琳友 洪溪屏 蔡元暉

腦出血具有高發(fā)生率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)，目前尚無(wú)明確和有效的治療手段。當(dāng)前研究表明，腦出血后腦水腫和腦組織繼發(fā)性損傷與炎性介質(zhì)的大量表達(dá)密切相關(guān)［1］。核因子－κB(nuclear factor－κB，NF－κB)作為一種廣泛存在、功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子，其活化后可調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)，從而在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用，但NF－κB如何在腦出血后炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用，尚不十分清楚［2］。為此，本研究建立大鼠腦出血模型，觀察亞低溫對(duì)模型大鼠腦水腫及NF－κB和AQP－4表達(dá)的影響，為亞低溫在腦出血中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1．動(dòng)物和材料:成年雄性 SD大鼠96只，4周齡，體重304．5±25．4g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司;EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司;AQP－4和β－actin抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2動(dòng)物分組和模型制備:將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成3組:假手術(shù)組(SO)、常溫組(NT)和亞低溫組(HT)，每組再分別按1、2、3和4天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每組8只大鼠。按照Xue等［3］報(bào)道的將自體股動(dòng)脈血注入大鼠尾殼核的方法制備實(shí)驗(yàn)性腦出血模型，假手術(shù)組制備過(guò)程完全一致，但進(jìn)針尾殼核后不注血。大鼠醒麻醉后，根據(jù)Longa EZ等［4］的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，首次評(píng)分在1～3分者為造模成功，作為本次實(shí)驗(yàn)用大鼠。

3．實(shí)施亞低溫:HT組在制備腦出血模型后即刻開(kāi)始用冰袋及動(dòng)物表面噴灑乙醇實(shí)施亞低溫，使大鼠肛溫在10min內(nèi)降至33．0±0．4℃，并維持2h，治療結(jié)束后采用白熾燈局部加熱法，使動(dòng)物肛溫恢復(fù)正常;假手術(shù)組和常溫組采用白熾燈局部加熱法，通過(guò)調(diào)節(jié)燈泡與大鼠的距離使大鼠肛溫保持在37.0±0．3℃。腦溫的測(cè)試和維持采用電子溫度計(jì)測(cè)量大鼠肛溫間接代替腦溫。

4．腦組織水分含量測(cè)定:實(shí)驗(yàn)大鼠分別在腦出血后第1、2、3和4天，戊巴比妥鈉麻醉后斷頭取腦，將大腦半球自中線切開(kāi)，切取血腫周?chē)X組織，濾紙吸干腦組織表面水分及血漬，稱(chēng)取腦濕重(g)后至60℃烤箱中干燥48h至恒重后稱(chēng)取干重(g)，計(jì)算腦含水量。腦組織含水量(%)=(濕重－干重)×100%。

5．EMSA實(shí)驗(yàn):取不同組別腦組織提取核蛋白。EMSA實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［5］，探針序列為:5'－TACTAGCTACCTCGTGTCAG－3'，將6．5%非變性聚丙烯酰胺凝膠在電壓為120V條件下恒壓電泳60min，取10μg核蛋白加入超純水中室溫反應(yīng)30min后再加入生物素標(biāo)記探針，在室溫下反應(yīng)30min后電泳100min再印跡轉(zhuǎn)移，用帶正電荷尼龍膜380mA恒流電轉(zhuǎn)40min，轉(zhuǎn)移完后將尼龍膜至于紫外燈下交聯(lián)15min，將膜再用30ml封閉液在室溫下反應(yīng)20min，最后將膜放入平衡液中反應(yīng)15min，化學(xué)發(fā)光顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One 4．6．2(BIO，RAD)軟件分析，計(jì)算灰度值。

6．Western blot法檢測(cè)腦組織中蛋白的表達(dá):將腦組織粉碎后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液。用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20微克/孔)，常規(guī)8%SDS－PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶1000)于4℃下孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗(1∶2500)室溫孵育1h，ECL顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One軟件分析，以β－actin為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

圖1 EMSA檢測(cè)各組在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)腦組織NF－κB活性

結(jié) 果

1．各組腦組織含水量的變化:在不同時(shí)間點(diǎn)，與SO組相比較，NT組腦組織含水量均明顯升高(P＜0．05)，高峰出現(xiàn)在第4天。與NT組相比較，在第1天，HT組大鼠腦組織含水量無(wú)明顯差異(P＞0．05)，而在第2天、第3天和第4天中HT組大鼠腦組織含水量均顯著減少(P＜0．05)，詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化(%，±s，n=8)

表1 各組大鼠腦組織含水量的變化(%，±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

組別 1天 2天 3天 4天15．21 NT 組 84．28 ±15．28* 86．34 ±12．38* 88．37 ±10．67* 89．36 ±10．28 HT 組 77．28 ±14．46 71．30 ±15．85# 71．05 ±13．94# 72．19 ±13．57 SO 組 67．84 ±12．54 68．18 ±18．26 66．84 ±15．29 67．38 ±#

2．EMSA檢測(cè)NF－κB活性:各組大鼠腦組織均有不同程度NF－κB活性表達(dá)(圖1)。在不同時(shí)間點(diǎn)，NT組與SO組相比較，NF－κB活性均明顯增強(qiáng)(P ＜0．05)，NF－κB活性在NT組中在第1天時(shí)達(dá)峰。HT組大鼠NF－κB活性在造模1天后開(kāi)始呈時(shí)間依賴(lài)性下降，在各時(shí)間點(diǎn)NT組NF－κB活性表達(dá)均明顯低于NT組(P＜0．05)，詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦組織NF－κB活性灰度值比較(±s，n=8)

表2 各組大鼠腦組織NF－κB活性灰度值比較(±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

組別 1天 2天 3天 4天0．076 NT 組 3．658 ±0．328* 2．749 ±0．435* 2．692 ±0．258* 2．464 ±0．317*HT 組 2．157 ±0．193# 1．042 ±0．098# 0．958 ±0．126# 0．884 ±0．094 SO 組 0．598 ±0．045 0．628 ±0．051 0．574 ±0．061 0．583 ±#

3．亞低溫對(duì)大鼠腦組織AQP－4蛋白表達(dá)的影響:各組大鼠腦組織中AQP－4蛋白均有表達(dá)。與SO組相比較，各時(shí)間點(diǎn)中NT組中AQP－4蛋白表達(dá)均顯著增加(P＜0．05)，NT組中大鼠腦組織AQP－4蛋白在第2天時(shí)達(dá)峰。與NT組相比較，亞低溫作用后大鼠腦組織中AQP－4 的表達(dá)水平均顯著降低(P＜0．05，表3、圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組大鼠腦組織中AQP－4蛋白表達(dá)(以β－actin為內(nèi)參)

表3 各組大鼠腦組織AQP－4蛋白灰度值比較(±s，n=8)

表3 各組大鼠腦組織AQP－4蛋白灰度值比較(±s，n=8)

與 SO 組相比較，*P ＜0．05;與 NT組相比較，#P ＜0．05

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4．NF－κB活性與AQP－4蛋白表達(dá)的相關(guān)性:對(duì)NF－κB活性與AQP－4蛋白表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，NF－κB活性表達(dá)與AQP－4蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0．945，P ＜0．01)。

討 論

目前我國(guó)每年新發(fā)40萬(wàn)例腦出血患者，發(fā)生腦出血后30天的病死率可達(dá)50%，其中一半以上發(fā)生在發(fā)病后的24h內(nèi)，嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量［5］。腦出血后腦組織損傷的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，凝血酶、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體和血紅蛋白及其產(chǎn)物等機(jī)制均參與了腦出血后周?chē)M織水腫形成，而炎癥反應(yīng)則是腦水腫形成的最直接因素。

NF－κB是近年來(lái)研究較多的一種功能多樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，通常以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到出血、炎癥和損傷等刺激后NF－κB被激活，并進(jìn)入細(xì)胞核中與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，活化后的NF－κB可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和炎性酶等基因的表達(dá)［6］。有研究表明，腦出血后數(shù)分鐘可形成血腫，在出血后1h開(kāi)始繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，而NF－κB在腦出血后數(shù)小時(shí)就被激活，從而在腦出血后腦水腫炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［7］。另外，NF－κB激活后還可調(diào)控多種抗凋亡蛋白，同時(shí)在保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗凋亡中也發(fā)揮了一定作用［8］。水通道蛋白(AQPs)是一組近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水通道蛋白廣泛分布于機(jī)體組織中，在介導(dǎo)水跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用，其中水通道蛋白－4(AQP－4)在腦組織中含量最為豐富，主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞中，并在腦血液灌注和水腫形成與消退中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此與腦水腫的關(guān)系密切，抑制AQP－4的表達(dá)可減輕腦出血后腦損傷［9～11］。但目前尚未有NF－κB與AQP－4相關(guān)性研究報(bào)道。

本研究采用Xue等［3］報(bào)道的自體股動(dòng)脈血向大鼠尾殼核注射的方法，注血量為50μl，與人類(lèi)約50ml常見(jiàn)出血量相似，同時(shí)腦出血大鼠出現(xiàn)明顯對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙和意識(shí)障礙等神經(jīng)功能損傷的表現(xiàn)，從而成功復(fù)制出腦出血模型［12］。對(duì)大鼠腦出血后腦組織含水量進(jìn)行分析可知，從第1天開(kāi)始，腦出血后腦組織含水量明顯增加，呈明顯時(shí)間依賴(lài)性，高峰出現(xiàn)在第4天;通過(guò)檢測(cè)腦出血后腦血腫周?chē)M織NF－κB活性，發(fā)現(xiàn)NF－κB在腦出血后被廣泛激活，NF－κB活性在第1天時(shí)達(dá)到高峰，然后逐漸下降，在第4天時(shí)仍高于對(duì)照組，與張軒等［13］研究結(jié)果相似，但高峰持續(xù)時(shí)間較短，這可能與NF－κB活性表達(dá)在不同腦出血模型中表達(dá)異常有關(guān)，而AQP－4在腦出血后第1天開(kāi)始表達(dá)明顯增加，隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，AQP－4的表達(dá)也隨之升高，高峰出現(xiàn)在第2天，較NF－κB活性表達(dá)高峰(1天)延遲，在第3天和第4天，AQP－4的表達(dá)又逐漸降低。分析可知，AQP－4的表達(dá)與NF－κB活性表達(dá)曲線基本吻合，提示AQP－4的表達(dá)與NF－κB活性在大鼠腦出血模型中存在關(guān)聯(lián)，對(duì)NF－κB活性表達(dá)和AQP－4蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析表明兩者呈正相關(guān)，表明NF－κB和AQP－4在大鼠腦出血后腦血腫及炎癥中存在一定的協(xié)同作用，NF－κB被激活后可能通過(guò)上調(diào)AQP－4的表達(dá)從而發(fā)揮作用。在本研究中腦出血后腦水腫高峰時(shí)間在第4天，遲于NF－κB活性表達(dá)和AQP－4蛋白表達(dá)高峰，進(jìn)一步表明腦出血后可激活NF－κB，進(jìn)而調(diào)控AQP－4的表達(dá)，AQP－4表達(dá)增加可引起血腦屏障通透性增加，最終導(dǎo)致腦組織含水量的增加。因此，大鼠腦出血后腦組織含水量與NF－κB的激活顯著相關(guān)，NF－κB在調(diào)控腦出血后水腫形成的病理生理過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

亞低溫是一種利用物理手段使得機(jī)體溫度降至32～35℃，研究表明，亞低溫在腦卒中和缺血再灌注等疾病中發(fā)揮了一定的保護(hù)腦神經(jīng)功能的作用，但機(jī)制尚未十分明確［14］。有研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子－1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可能在亞低溫發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用中發(fā)揮了一定作用［15］。另外亞低溫需要考慮持續(xù)時(shí)間對(duì)療效的影響，因此本次研究參考宋宇等［16］的方法采用相對(duì)短的時(shí)間(2h)作為本次實(shí)驗(yàn)中亞低溫的持續(xù)時(shí)間，從而避免深低溫對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)。在本次實(shí)驗(yàn)中，在大鼠腦出血后隨機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施亞低溫治療，筆者發(fā)現(xiàn)亞低溫可明顯降低大鼠腦出血后腦組織含水量，另外亞低溫還可顯著抑制NF－κB的活性表達(dá)和AQP－4表達(dá)，從而表明亞低溫可能通過(guò)抑制NF－κB的活性表達(dá)來(lái)抑制AQP－4的表達(dá)，最終抑制腦出血后腦組織炎癥程度，來(lái)達(dá)到對(duì)腦出血后腦保護(hù)的作用。雖然NF－κB的活性表達(dá)在早期可能具有短暫性的抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用，但NF－κB的持續(xù)激活可調(diào)控炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)中多種蛋白的表達(dá)，最終對(duì)腦組織產(chǎn)生損害作用。因此，鑒于NF－κB的激活對(duì)腦組織具有保護(hù)和破壞的雙重作用，在臨床應(yīng)用亞低溫治療腦出血時(shí)，如何將NF－κB的活性表達(dá)控制在一個(gè)合理范圍內(nèi)，有待于進(jìn)一步研究。

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