石棉暴露下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

周 煦 劉 剛

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損傷可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)，長期過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。此前的研究提示線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡是石棉引起細(xì)胞凋亡的主要途徑［1］，ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑，近年ERS 所啟動的凋亡途徑以其獨特的地位受到越來越多的關(guān)注。由于肺泡上皮細(xì)胞(Alveolar Epithelial Cell，AEC)的凋亡代表了一個慢性肺間質(zhì)纖維化的早期活動，而石棉肺早期的病理變化類似于特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)［2-3］，因此我們以AEC 作為研究對象探討石棉引起AEC 凋亡的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌上皮細(xì)胞株A549 購于American Type Culture Collection(ATCC)。DMEM、FBS(GIBCO Invitroge 公司);BIP，IRE-1α，GRP94，BAK，BAX 抗體(Cell Signaling Technology 公司);β-actin(Santa Cruz 公司)。

1.2 儀器

激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)TCS SP5 II(Leica 公司);熒光成像系統(tǒng)VersaDocMP5000(Bio-Rad 公司);生物培養(yǎng)箱Thermofisher144L(Thermo 公司);高速離心機(jī)Minispin(Eppendorf公司);電熱恒溫水箱CU420(Julabo 公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。

1.3.2 石棉處理 采用不銹鋼剪刀將石棉(產(chǎn)于青海芒崖)纖維狀礦物材料剪碎，PBS 配成5 mg/ml 濃度的懸濁液，經(jīng)超聲分散與充分振蕩混勻，高壓蒸汽滅菌后備用。石棉纖維的分散度大約70%為可吸入(2 ～5 μm)。

1.3.3 免疫熒光染色 甲醛固定細(xì)胞，利用Triton-X-100 使部分膜蛋白變性，羊血清封閉，一抗孵育過夜，次日沖洗三次，每次10 min，加入二抗，2 h 后沖洗，加入抗熒光淬滅劑后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、采集圖像。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計。所得數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較應(yīng)用方差分析及q 檢驗。p ＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

石棉處理A549 細(xì)胞后，ERS 標(biāo)志蛋白Bip、IRE-1α 和GRP94，以及促凋亡基因BAX、BAK 蛋白表達(dá)均上調(diào)，且與石棉暴露時間呈正相關(guān)。

圖1 石棉暴露下ERS 相關(guān)蛋白和促凋亡基因BAX、BAK 的變化

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)以保護(hù)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷［4］，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理，有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活，但是如果損傷太過嚴(yán)重以致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起細(xì)胞凋亡，信號就會由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換［5-6］。

Bip 是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重要分子伴侶，與許多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白都有短暫的相互作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個感應(yīng)器，參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)等諸多生物學(xué)過程。結(jié)果顯示:石棉處理A549 細(xì)胞后，通過檢測作為ER 穩(wěn)態(tài)感受器以及UPR 標(biāo)志蛋白的Bip(Immunoglobulin Binding Protein，or Glucose Regulating Protein，又稱為GRP78)，免疫印跡結(jié)果顯示該蛋白表達(dá)上調(diào)，且與作用時間呈正相關(guān)，提示ERS 參與了石棉引起的細(xì)胞凋亡。IRE-1(Inositol-Requiring Enzyme 1)通路是ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的三大通路之一，IRE-1 感受ERS 的過程與Bip 的游離有關(guān)。當(dāng)ER 穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)大量未折疊蛋白聚集，Bip 與IRE-1 解離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。當(dāng)ERS 反應(yīng)程度過強(qiáng)或持續(xù)時間過長時，損傷超過修復(fù)能力，IRE -1 可啟動凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GRP94 作為應(yīng)激蛋白，可能也與細(xì)胞凋亡存在一定的關(guān)系［7］。

長期以來，大多研究認(rèn)為AEC 凋亡主要通過線粒體途徑和死亡受體途徑介導(dǎo)［8-9］，而我們最近的研究發(fā)現(xiàn):石棉暴露下，A549 細(xì)胞(具有AEC 特性)上ERS 標(biāo)志蛋白IRE -1 和GRP94 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實ERS 途徑參與了石棉引起的細(xì)胞凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)A549 細(xì)胞經(jīng)石棉處理后，Bcl -2家族中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的BAX、BAK［10］的表達(dá)與ERS 相關(guān)蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，已有報告顯示BAX 和BAK可能通過與IRE-1α 的直接作用來調(diào)控UPR［11］。

細(xì)胞凋亡本身具有兩面性，同樣具有兩面性的ERS 引起細(xì)胞凋亡時，信號會由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換，該轉(zhuǎn)換具體通過什么途徑實現(xiàn)?石棉暴露下，ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的許多方面仍未明確，需要我們更進(jìn)一步的研究闡明該細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)控機(jī)制。

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