竹材木質(zhì)素高效降解菌的分離篩選及鑒定

劉 劍，劉君昂，周國英，李 河，楊 菁

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

竹材木質(zhì)素高效降解菌的分離篩選及鑒定

劉 劍，劉君昂，周國英，李 河，楊 菁

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

采用愈創(chuàng)木酚變色、苯胺藍平板退色和酶活性測定篩選出高效降解竹材木質(zhì)素的菌株。結(jié)果表明：通過腐爛的竹材等34份樣品分離純化出139株真菌;通過0.04%愈創(chuàng)木酚和0.1‰苯胺藍平板初篩，從分離純化的139株真菌中篩選出具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶活性的7株降解菌；7株降解菌經(jīng)液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基復(fù)篩得到2株高效產(chǎn)降解木質(zhì)素酶活的菌株：培養(yǎng)7 d，漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶活性分別達72.558、23.769、55.044 和34.611、38.781、82.646 U/mL；2株降解菌FG-35和FG-98 分別鑒定為革耳菌Panus lecomtei和煙管菌Bjerkandera adustus。

竹材；木質(zhì)素；降解菌；分離篩選；鑒定

我國竹材資源非常豐富，栽培面積達7.20×106hm2，占到世界竹材面積的40%，同時我國的竹林面積增長較快，僅湖南省的竹林面積達6.278×105hm2。而竹纖維具有抗菌性、吸濕性、透氣性等優(yōu)點被稱為繼棉、麻、絲、毛之后的“第五大纖維”，因此有關(guān)竹原纖維的開發(fā)很有必要[1-5]。但由于木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)構(gòu)成的高分子聚合物，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、物理和化學(xué)性質(zhì)不均一、極性強與纖維素等物質(zhì)結(jié)合緊密等問題，從而使木質(zhì)素難降解，而木質(zhì)素在自然界中完全降解是由于多種微生物共同作用的結(jié)果，其中真菌起主要的降解作用，典型的木質(zhì)素降解菌是白腐真菌。目前有關(guān)木質(zhì)素降解菌株的研究主要集中在黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、變色栓菌Trametes versicolor等白腐菌[6-10]，而關(guān)于竹材木質(zhì)素的微生物降解菌株的篩選報道研究卻很少。基于此，該研究從腐爛的竹材中篩選出2株對竹材木質(zhì)素降解有很高酶活性的真菌菌株，為生物酶法制備竹原纖維提供依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

分離樣品所采用的腐爛竹材均采于湖南省攸縣黃豐橋國有林場天然竹林。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基：PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基；PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加愈創(chuàng)木酚(質(zhì)量濃度計0.04%)；PDA-苯胺藍培養(yǎng)基：PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入苯胺藍（質(zhì)量濃度計0.1‰）[11]；液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：參考文獻[12]。

1.3 方 法

1.3.1 竹材木質(zhì)素降解菌株篩選

竹材木質(zhì)素降解菌株的分離純化；降解菌株的愈創(chuàng)木酚顯色篩選：將分離純化的菌株通過愈創(chuàng)木酚法進行初篩。方法參考文獻略有改動[13-14]，在實驗中加入0.04%質(zhì)量濃度的愈創(chuàng)木酚；降解菌株的苯胺藍退色篩選：將分離純化的菌株通過苯胺藍退色法進行篩選方法參考文獻[11-15]；降解菌株的復(fù)篩；3種主要降解木質(zhì)素酶活力的測定：漆酶(Lac)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[16]；木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性的測定方法：采用藜蘆醇法[17]；錳過氧化物酶(MnP)活性的測定方法[18]。

1.3.2 竹材木質(zhì)素降解菌株鑒定

（1）菌落的形態(tài)學(xué)觀察；（2）菌株的ITS分子鑒定：降解菌株基因組總DNA的提取方法采用CTAB法[19]；對18SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[20]；PCR擴增條件參考文獻[21]，將PCR擴增的產(chǎn)物委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序；再利用MEGA軟件進行系統(tǒng)進化發(fā)育分析，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹材木質(zhì)素降解菌的篩選與分離

根據(jù)菌落形態(tài)通過菌液稀釋和平板劃線法從34份樣品中分離純化得到139株真菌。

2.2 竹材木質(zhì)素降解菌株的初篩

2.2.1 PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)

由2.1所分離純化的139株真菌進行PDA-愈創(chuàng)木酚平板反應(yīng)試驗，其中23株真菌在PDA-愈創(chuàng)木酚平板上先后發(fā)生了不同程度的顯色反應(yīng)，顏色反應(yīng)結(jié)果見表1，發(fā)生顏色變化的顯色圖見圖1(A)。

表1 初篩木質(zhì)素降解菌的愈創(chuàng)木酚顯色?Table 1 Primary screen results of discoloration in guaiacol-PDA plates by lignin-degrading fungus

由表1可以看出，只有23株真菌在愈創(chuàng)木酚的平板上發(fā)生了顯色反應(yīng)（見圖1），可以清晰的看出PDA-愈創(chuàng)木酚平板上有明顯的紅褐色的顯色圈。其中 FG-25、FG-35、FG-44、FG-48、FG-54、FG-65和FG-98等7株菌株發(fā)生顯色的時間較快且顏色變化程度也逐漸加深，說明這7株真菌產(chǎn)漆酶能力較強；而菌株FG-03、FG-11、FG-14、FG-15、FG-17、FG-18、FG-28、FG-32、FG-39、FG-46、FG-64、FG-78、FG-80等 16個菌株發(fā)生顯色時間較晚，并且顏色變化不明顯，初步說明這16株產(chǎn)漆酶能力不強。

2.2.2 PDA-苯胺藍平板退色反應(yīng)

根據(jù)愈創(chuàng)木酚平板變色的結(jié)果，使PDA-愈創(chuàng)木酚發(fā)生變色的23株真菌進行苯胺藍退色試驗，而23株真菌中僅有7株菌發(fā)生了退色反應(yīng)（實驗結(jié)果見表2），發(fā)生退色反應(yīng)的退色圖見圖1(B)。

圖1 平板顯色反應(yīng)和退色反應(yīng)Fig.1 Diagram of color and fading reaction in plate

表2 初篩木質(zhì)素降解菌的苯胺藍退色?Table 2 Primary screen results of de-colorization in aniline blue-plates by lignin-degrading fungus

通過表2可以看出，23株使愈創(chuàng)木酚發(fā)生變色的菌株在苯胺藍平板上發(fā)生退色反應(yīng)的只有FG-25、FG-35、FG-44、FG-48、FG-54、FG65- 和FG-98等7株菌，并且退色程度在第7 d和第9 d時發(fā)生退色反應(yīng)比較明顯，特別是FG-35、FG-44和FG-98號菌退色程度比較明顯，由此可以初步說明7株菌均具有產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶等過氧化物酶的能力，特別是FG-35、FG-44和FG-98號3株真菌具有很好的產(chǎn)降解木質(zhì)素的過氧化物酶的能力；而其他的16株真菌均沒有發(fā)生退色反應(yīng)，說明不產(chǎn)生使木質(zhì)素降解的過氧化物酶類。

2.3 降解木質(zhì)素菌株的復(fù)篩

根據(jù)初篩平板的顯色反應(yīng)和退色反應(yīng)的結(jié)果，篩選出產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力較強的7個菌株(編號分別是 FG-25、FG-35、FG-44、FG-48、FG-54、FG-65和FG-98)，分別接種到裝有50 mL液體培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中，于28 ℃、160 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，對7株真菌進行主要的3種降解酶的測定，測定結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌株的3種木質(zhì)素降解酶酶活的比較Fig.2 Comparison among 3 kinds of lignin-degrading enzyme activities in different fungus

從圖2中可以看出：對于漆酶(Lac)，7株菌均有漆酶的產(chǎn)生，菌株FG-35的酶活力最高，菌株FG-98次之，而菌株FG-48和FG-65的產(chǎn)酶能力相對較小。在初篩時雖然在PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)中有顯色反應(yīng)，但卻不如在PDA-苯胺藍平板退色反應(yīng)中退色明顯，可能這2個菌株產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶的能力更強。對于木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)，菌株FG-98酶活力最高，菌株FG-48次之。相比FG-48菌株FG-35稍弱一點；而對于錳過氧化物酶(MnP)，菌株FG-65酶活力最高，菌株FG-98次之。雖然菌株FG-48木質(zhì)素過氧化物酶的活力相對高些，但漆酶和錳過氧化物酶的活力相對較低，同時菌株FG-65錳過氧化物酶的活力最高，但漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶的活力很低。綜合以上結(jié)果，菌株FG-35和FG-98具有較高的產(chǎn)木質(zhì)素酶的綜合能力。

2.4 菌株FG-35和FG-98的鑒定

菌株FG-35的鑒定：在PDA培養(yǎng)基上觀察到的形態(tài)特征是菌落呈圓形，白色菌絲，表面絨毛狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，同時測得的堿基序列長度為606 bp，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行相似性分析，得出與Panus lecomtei的ITS序列相似性較高達到98%，構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹（見圖3）。結(jié)果表明，F(xiàn)G-35號菌株與接收號為JQ955726的菌株的ITS區(qū)相似性最為接近。因此結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步確定FG-35菌株為革耳菌Panus lecomtei。

菌株FG-98的鑒定：FG-98號菌落特征是在PDA培養(yǎng)基上呈圓形扁平，白色菌絲，表面棉絮狀，與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，同時DNA測序得到堿基的序列為751 bp，同時將所測得的序列與GeneBank中的18S rDNA的ITS序列進行比對，進行相似性分析，發(fā)現(xiàn)FG-98號菌株與Bjerkandera adustus的ITS序列最為接近，相似性達到99%，構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹（見圖4），F(xiàn)G-98菌株與接收號為AY089741的菌株的ITS序列最為接近。結(jié)合菌落的形態(tài)特征，初步確定FG-98號菌株為煙管菌Bjerkandera adustus。

3 結(jié)論與討論

圖3 FG-35菌株的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 ITS phylogenetic tree of the strain FG-35

圖4 FG-98菌株的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 ITS phylogenetic tree of the strain FG-98

從腐爛的竹材等34份樣品中通過平板稀釋和平板劃線的方法直接分離純化出139株真菌；對139株真菌進行愈創(chuàng)木酚變色和苯胺藍退色反應(yīng)初篩，初步判定得到7株具有降解木質(zhì)素能力的菌株；而FG-35號和FG-98號菌株不僅在愈創(chuàng)木酚的變色反應(yīng)中發(fā)生變色反應(yīng)較快且顏色變化程度也比較明顯，而且在苯胺藍的退色反應(yīng)中發(fā)生退色較快同時退色比較完全。

通過木質(zhì)素降解菌的初篩和復(fù)篩最終篩選出7株菌，對7株菌進行木質(zhì)素酶活力的測定結(jié)果表明，F(xiàn)G-35和FG-98號菌株明顯比其他5株菌的木質(zhì)素降解的綜合酶活力高。

（3）對得到的2株優(yōu)良的竹材木質(zhì)素降解菌進行菌落形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，確定FG-35和FG-98號菌株分別是側(cè)耳科革耳菌Panus lecomtei和多孔菌科煙管菌Bjerkandera adustus。

（4）木質(zhì)素的降解一直是研究者研究的一個難題，由于木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，針對不同的植物的存在形式不同，也為木質(zhì)素的降解帶來了很大的難度。雖然有關(guān)木質(zhì)素降解的研究有很多，而絕大部分的研究都具有一定的針對性，針對稻草、秸稈和煙草的木質(zhì)素降解的篩選等相關(guān)研究有很多[22-24]，但是目前針對竹材木質(zhì)素降解的研究卻很少，而竹材木質(zhì)素難降解一直是研究的一個難題，從而限制了對竹材的開發(fā)和利用。該研究所篩選的菌株是從天然竹林中腐爛的竹材等樣品中篩選的菌株，對竹材木質(zhì)素的降解更具針對性，為研究與降解竹材木質(zhì)素有關(guān)的實際應(yīng)用提供借鑒和參考。

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Isolation, screening and identif i cation of high effective bamboo-lignin degradation fungus

LIU Jian, LIU Jun-ang, ZHOU Guo-ying, LI He, YANG Jing
(Key Lab. of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees Co-constructed by Provinces and State Ministry of Education,Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

Fungal strains with highly lignin-degrading enzymes activity were screened by colorful reactions of guaiacol-PDA plates,aniline blue-plates and determination of enzymes activity. The results indicate that the 139 fungal strains of fungi were isolated and purif i ed from 34 decayed bamboo samples; And the 7 fungal strains with highly enzymes activity were fi nally obtained from 139 fungal strains by using guaiacol-PDA plates (containing 0.04% guaiacol) and aniline blue-plates; Then the 7 fungal strains were taken into the liquid medium for determining their’s enzymes activity; Finally, two fungal strains (FG-35, FG-98) with the highly lignin-degrading enzymes activity, were produced after were cultivate for 7 days, which were identif i ed to be Panus lecomtei and Bjerkandera adustus;The Lac activities, LiP activities and MnP activities of the two fungal strains were: 72.558, 23.769, 55.044 and 34.611, 38.781, 82.646U/mL, respectively.

bamboo wood; lignin; degrading fungus; isolation and screening; identif i cation

S795；S718.8

A

1673-923X(2014)08-0048-05

2013-09-28

湖南省科技重大專項（2011FJ1006）；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（201004014）；中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新基金項目（CX2012B15）

劉 劍（1986-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事林業(yè)應(yīng)用微生物研究

周國英（1966-），女，湖北應(yīng)城人，教授，博士，主要從事林業(yè)微生物研究；E-mail：gyzhou2118@163.com

[本文編校：文鳳鳴]