鎘脅迫對白三葉的富集能力、葉片顯微結(jié)構(gòu)及其生理特性的影響

韓寶賀，朱宏

（哈爾濱師范大學生命科學與技術學院 黑龍江省植物分子生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150025）

近年來，隨著經(jīng)濟和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的飛速發(fā)展，工業(yè)“三廢”排放量日益增加，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥和農(nóng)藥的過量噴施，以及城市建設進程的進一步加快，使得重金屬污染愈加嚴重［1］，其中，尤屬鎘土壤污染最為嚴重。鎘（Cd）是生物生長發(fā)育的非必需元素，具較高毒性且極易被吸收，其本身具有高移動性和高毒害性，極小濃度即可產(chǎn)生極大毒害，被認定是危害最嚴重的重金屬污染物［2］。我國受重金屬Cd污染的草地及耕地面積超過2000萬hm2，這不僅嚴重影響了作物的產(chǎn)量，且進入土壤環(huán)境中的Cd離子，一旦積累在植物的可食用部位，便通過食物鏈影響到人類健康，會導致神經(jīng)和腎功能異常，骨骼病變，并能引發(fā)骨痛病、肺氣腫、高血壓等多種疾病，因而重金屬污染問題日益突出［3］。

白三葉（Trifoliumrepens）屬于豆科（Leguminosae）車軸草屬（Trifolium），又稱白花苜蓿，白車軸草，具有優(yōu)良的牧草品質(zhì)，產(chǎn)量高，生長適應性強，過去多作為牧草栽培［4］。由于白三葉具有分枝多，根系發(fā)達，生物量大，再生速度快，適應性強，成坪迅速等優(yōu)點，使其成為觀賞型草坪和綠地建植的主要草種。最主要的是，在實際應用中，白三葉已經(jīng)被證明在重金屬污染土壤中具有良好的修復效果［5］，但當細胞內(nèi)的重金屬離子超過一定閾值時，細胞結(jié)構(gòu)便會產(chǎn)生一定的損傷。結(jié)構(gòu)是功能的基礎，結(jié)構(gòu)變化是植物一系列生理活動異常的細胞學基礎［6］，因此，研究植物受重金屬毒害后，細胞結(jié)構(gòu)的變化，以及Cd2＋脅迫對白三葉生理生化的影響，可以從細胞學上揭示重金屬毒害白三葉的機理，從生理學上闡述白三葉通過生理生化反應緩解Cd毒害的科學依據(jù)，對于開展白三葉抗重金屬耐性機制的研究具有應用價值。

目前，關于白三葉的研究主要集中在抗逆性（鹽堿脅迫、干旱脅迫、高溫脅迫）、化感作用，也有對其在植物修復中可能發(fā)揮的作用進行探討［7－9］。Cd2＋脅迫白三葉的研究更是處于對種子及幼苗的抗性進行研究的初級階段［10］，系統(tǒng)地闡述白三葉對Cd富集能力以及Cd2＋脅迫對白三葉顯微結(jié)構(gòu)及其生理特性的影響，尚未見報道。本試驗模擬不同濃度Cd2＋對白三葉的脅迫，通過測定白三葉地上部分和地下部分的Cd含量，比較不同濃度Cd2＋處理下，白三葉對Cd的吸收能力和轉(zhuǎn)運能力，從而為白三葉富集Cd潛力的評價提供基礎數(shù)據(jù)；比較Cd2＋脅迫下葉細胞顯微結(jié)構(gòu)的異同，并研究了白三葉在Cd2＋脅迫后的生理響應，以期探討白三葉抗Cd的耐性機制。

1 材料與方法

1．1 材料培養(yǎng)及處理

參照《牧草種子檢驗規(guī)程》GB／T2930．4－2001系列國家標準［11］，確定25℃為白三葉種子的適宜萌發(fā)溫度，恒溫培養(yǎng)箱無光照條件下發(fā)芽。萌發(fā)后，播種于培養(yǎng)缽（高20cm、底徑15cm、口徑20cm）中，基質(zhì)為蛭石∶細砂＝1∶1混合而成，每盆15株，共60盆，用Hoagland完全營養(yǎng)液定時定量澆灌培養(yǎng)，期間各項管理措施一致，在溫室中培養(yǎng)30d，待植物幼苗長出3片真葉，進行Cd2＋處理。試驗于2013年10月至2014年3月進行。

1．2 試驗方法

1．2．1 試驗設計 采用室內(nèi)盆栽試驗，模擬Cd脅迫。Cd2＋以溶液形式加入到培養(yǎng)缽中，重金屬離子濃度依據(jù)中華人民共和國國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準（GB15618－2008）3級土壤環(huán)境標準量進行配制，Cd2＋濃度梯度分別為100，200，300，400，500μmol／L，每個梯度均采用 Hoagland完全培養(yǎng)液配制而成，同時設置對照處理，對照組施以Hoagland完全培養(yǎng)液，處理時間為7d。

1．2．2 植物體含Cd量測定 重金屬測定采用原子吸收光譜儀（Thermo－ICE3000），采集待測白三葉的地下和地上（莖和葉）部分，自來水沖洗以去除粘附于植物樣品上的蛭石和細砂，再用去離子水沖洗2～3次，瀝去水分，在105℃下殺青30min后于70℃烘箱中烘至恒重，烘干后樣品用陶瓷研缽研碎，潔凈密封保存。測定方法按照黃朝表等［12］及GB／T17141－1997方法測定［13］，同時配制空白試劑作為對比，數(shù)據(jù)為3次重復的平均值。

1．2．3 葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察 采集待測白三葉的葉片，用含70%酒精的FAA固定液固定，固定時間均為24h以上。然后根據(jù)Feder和O’Brien的方法［14］，將材料置于乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）中滲透3次，前2次各為1d，第3次不少于5d，然后將裝有材料和GMA的膠囊，于60℃溫箱聚合24h，用Leica Ultralcut R切片，厚度為2～3μm。切片采用高碘酸－Schiff試劑／甲苯胺藍（PAS／TBO）法染色［15］，烘干切片，加拿大樹脂封片。裝片經(jīng) Olympus BX53顯微鏡觀察，Olympus DP26照相。

1．2．4 生理指標測定 待測生理指標的測定方法依次為：丙二醛（malondialdehyde，MDA）采用硫代巴比妥酸法測定［16］，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用 NBT 還原法測定［17］，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定［18］，過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法測定［19］。各處理組的生理指標均重復測定3次。

1．3 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS 17．0軟件制表和統(tǒng)計學分析。主要分析指標計算方法為：1）轉(zhuǎn)運系數(shù)＝植物地上部分元素的含量／地下部分同種元素含量。2）根系對重金屬的滯留率（%）［20］＝［（地下部分重金屬含量－地上部重金屬含量）／地下部分重金屬含量］×100。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同濃度Cd2＋對白三葉Cd含量和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

從表1可見，各器官（根、莖和葉部）對Cd的吸收能力有較大差別?？傮w而言，同一濃度時，各器官對Cd元素的富集量差異顯著，對Cd的富集能力表現(xiàn)為：根＞葉＞莖；相同器官的Cd含量，隨著Cd2＋濃度的增加，呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。100μmol／L與對照組相比，地下和地上部分的Cd富集含量均急劇增加，增幅分別為123．8%和40．4%。當Cd2＋濃度達到400μmol／L時，地下和地上部分（指莖和葉部）Cd含量增幅減緩，基本持平。本試驗中，白三葉地下和地上部分的Cd富集量均在500μmol／L時，達到最大，分別為3．490和0．910 mg／L，地下部分吸收能力大于地上部分，且不同Cd2＋濃度之間Cd富集量差異顯著（P＜0．05）。

轉(zhuǎn)運系數(shù)（translocation factor，TF）表征植物將重金屬由根部轉(zhuǎn)移到地上部的能力，可間接衡量植物對重金屬的耐性［21］。由表1可知，白三葉不同營養(yǎng)器官之間顯示出了較大差別。本試驗中，脅迫濃度為100μmol／L時，TF最高（平均值為0．313），表明此濃度時，根部具有較強的Cd轉(zhuǎn)移能力。脅迫濃度為200，300，400和500 μmol／L的TF分別為0．202，0．234，0．262，0．261，差異不顯著。

2．2 不同濃度Cd2＋對白三葉葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響

對照組白三葉葉片（圖1A）的上、下表皮均由1層細胞組成，上表皮細胞較大，下表皮細胞較小，細胞排列緊密。柵欄組織由單層長柱狀細胞排列而成，排列較為緊密。海綿組織細胞為圓形或橢圓形，較稀疏。

表1 白三葉植株體對重金屬的富集情況Table 1 Cd content，translocation factor and root retention rate in T． repens

圖1 白三葉不同Cd2＋脅迫下葉片的形態(tài)特征Fig．1 The morphological characteristics of the leaves of T． repens under different Cd2＋stress

白三葉在不同濃度Cd2＋處理下，上、下表皮細胞、柵欄組織細胞以及海綿組織細胞的形狀、大小及排列緊密程度，較對照組相比均出現(xiàn)了明顯變化，并且隨著受Cd2＋脅迫的時間延長、濃度越高，柵欄組織和海綿組織變化會越明顯。其中，在較低濃度（100μmol／L）時，白三葉葉片各結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的變化（圖1B）；從200μmol／L開始，葉片結(jié)構(gòu)變化明顯（圖1C）。在Cd2＋供應水平達到200μmol／L時，葉肉細胞的細胞壁著色加深，這可能與Cd元素的積累有關，此時，葉肉細胞的結(jié)構(gòu)仍較為清晰；300μmol／L時葉肉細胞排列疏松，柵欄組織長柱狀細胞縮短變粗，形態(tài)極不規(guī)則（圖1D）；在高濃度Cd2＋脅迫下（400和500μmol／L），葉肉細胞發(fā)生收縮扭曲，且細胞間隙明顯變大，尤其是海綿組織扭曲程度大，厚度越來越小，收縮嚴重（圖1E，F(xiàn)）。

2．3 Cd2＋脅迫對白三葉葉片光合色素含量的影響

Cd2＋脅迫后，白三葉葉片的 Chl a，Chl b和總?cè)~綠素的含量逐漸降低（表2）。本試驗中，隨著Cd2＋濃度的升高，Chl a的含量下降顯著，各處理組的含量差異顯著（P＜0．05），在最高處理濃度500μmol／L處理下，Chl a含量降至0．814mg／g，為對照的73．93%。Chl b的含量在100～300μmol／L Cd2＋脅迫下變化幅度較小，較對照無顯著差異，其中在低Cd2＋濃度（100，200μmol／L）時，Chl b的含量略升高。400μmol／L時，Chl b的含量下降，在500μmol／L時，降至最低，僅為對照的57．59%，且Cd2＋對葉綠素b的影響大于葉綠素a。總?cè)~綠素的含量也呈下降趨勢，而 Chl a／Chl b的變化卻恰恰相反。在低 Cd2＋脅迫下，Chl a／Chl b較對照降低，但隨Cd2＋濃度的升高，其比值亦逐漸升高，在500μmol／L達到2．951，較對照組差異顯著（P＜0．05）。

表2 Cd2＋脅迫對白三葉葉片光合色素含量的影響Table 2 Influence of Cd2＋ stress on photosynthetic pigment content in T． repensleaves

2．4 Cd2＋脅迫對白三葉葉片抗氧化物酶活力和MDA含量的影響

2．4．1 Cd2＋脅迫對白三葉葉片 MDA含量的影響 植物受到逆境脅迫時，通常會發(fā)生膜脂過氧化作用，而MDA是其最終分解的主要產(chǎn)物之一。MDA含量常用于評價植物體細胞膜的損傷程度，含量越高，說明植物細胞膜結(jié)構(gòu)損傷越嚴重，是一個重要的逆境生理指標［22］。由圖2可知，白三葉葉片的MDA含量呈上升趨勢。經(jīng)過不同濃度Cd2＋脅迫7d，白三葉葉片的 MDA含量變化相關方程為Y＝3．5903X＋7．8473（R2＝0．9085），由此可知，MDA含量變化與Cd2＋濃度呈正相關。100μmol／L處理下，MDA含量為16．52μmol／g FW，是對照的193．22%，差異顯著（P＜0．05）。200，300，400μmol／L處理下，MDA含量分別為21．35，23．25，23．99μmol／g FW，較對照組差異顯著（P＜0．05），但三者間無顯著差異。在500μmol／L處理下，白三葉葉片的MDA含量達到28．82μmol／g FW，較對照升高了337．08%，與其余各處理組間差異顯著（P＜0．05）。

圖2 Cd2＋脅迫下白三葉葉片丙二醛含量的變化Fig．2 Effect of Cd2＋ stress on MDA content in leaves of T． repens

圖3 Cd2＋脅迫下白三葉葉片超氧化物歧化酶活性的變化Fig．3 Effect of Cd2＋ stress on SOD activities in leaves of T． repens

2．4．2 Cd2＋脅迫對白三葉葉片SOD活性的影響 經(jīng)過Cd2＋脅迫7d，各試驗組間的SOD活性，隨著脅迫濃度的升高，呈先升高后降低的趨勢（圖3）。較對照組而言，不同處理分別上升了150．28%，173．68%，202．16%，156．21%，133．77%，且各試驗組間SOD活性均顯著高于對照組（P＜0．05）。100μmol／L脅迫7d，白三葉葉片SOD活性迅速升高，在300μmol／L處理下，其活性達到了206μg／（g FW·min），在500μmol／L時，降至136 μg／（g FW·min），但仍顯著高于對照組（P＜0．05）。

2．4．3 Cd2＋脅迫對白三葉葉片POD活性的影響 從圖4可知，脅迫7d后，各試驗組間POD活性發(fā)生了明顯的變化，整體的變化趨勢為先上升后下降。從整個脅迫過程分析，除500μmol／L處理外，各組間活性均較對照組差異顯著（P＜0．05）。低濃度Cd2＋（100，200μmol／L）脅迫，即可使白三葉葉片POD活性急劇上升，升高幅度為對照的155%和198%，在300μmol／L處理下，POD活性達到470μg／（g FW·min），為對照組的2．16倍，此后，POD活性下降，至500μmol／L時，下降至252μg／（g FW·min），僅為對照組的1．16倍，與對照組活性差異不顯著。

2．4．4 Cd2＋脅迫對白三葉葉片CAT活性的影響 白三葉葉片的CAT活性在Cd2＋脅迫后的變化趨勢與SOD和POD一致，即隨著Cd2＋脅迫濃度的增加，CAT活性先升高后降低（圖5）。0～500μmol／L處理組的平均CAT 活性分別為32．13，60．11，82．67，96．67，72．11，64．44μmol／（g FW·min）。

圖4 Cd2＋脅迫下白三葉葉片過氧化物酶活性的變化Fig．4 Effect of Cd2＋ stress on POD activities in leaves of T． repens

圖5 Cd2＋脅迫下白三葉葉片過氧化氫酶活性的變化Fig．5 Effect of Cd2＋ stress on CAT activities in leaves of T． repens

2．4．5 Cd2＋脅迫下，白三葉各生理指標間的相關性分析 對Cd2＋脅迫下，各項生理指標的相關性進行分析（表3）。Chl a和 Chl b含量與 Cd2＋濃度之間呈極顯著負相關（P＜0．01），Chl a和Chl b含量間呈極顯著正相關（P＜0．01）；MDA含量與Cd2＋濃度之間呈極顯著正相關（P＜0．01），MDA 含量與 Chl a和 Chl b含量之間呈極顯著負相關（P＜0．01）；MDA含量與SOD活性呈顯著正相關（P＜0．05），與CAT活性呈極顯著正相關（P＜0．01）；而SOD，POD，CAT三者間呈極顯著正相關（P＜0．01）。

3 討論

3．1 白三葉對重金屬Cd的富集情況

重金屬累積能力是重金屬污染土壤修復時植物種選擇的一個重要指標［23］。目前，Cd超富集植物標準的認定，廣泛采用Tang等［24］提出的參考值（100 mg／kg）。白三葉已經(jīng)被證明對Cd具有很強的富集力，是一種Cd超富集植物［9］，但本研究所測白三葉的Cd富集量與之相距甚遠。究其原因，可能是脅迫時間短所致，可進一步延長脅迫時間至30～60d，來進一步印證白三葉對Cd的富集能力。

表3 Cd2＋濃度、葉綠素、膜脂過氧化指標以及抗氧化酶之間的相關性分析Table 3 Correlation analysis among Cd2＋ concentration，chlorophyll，MDA and antioxidant enzyme

Cd在白三葉體內(nèi)的分布有2種情況，一是積累在根部；另一種是把根系吸收的重金屬進一步運輸?shù)降厣喜浚⑼ㄟ^蒸騰作用或葉的脫落，從植物體排出，減少Cd對白三葉的毒害［25］。本試驗表明，白三葉對重金屬Cd具有一定的累積作用，且同一濃度時，各器官對Cd的富集能力表現(xiàn)為：根＞葉＞莖，根部TF為0．202～0．313。與王春光等［26］的同一樹種不同器官內(nèi)重金屬富集量的結(jié)論一致，所以，在白三葉短期內(nèi)受Cd脅迫的情況下，根部滯留是白三葉積累Cd的主要方式，其含量為1．238～3．490mg／L，滯留率最高可達83．13%；而地上部分Cd積累量較低，為0．404～0．910mg／L。因而，白三葉在短期Cd脅迫的條件下，其防御措施可能是通過降低Cd向地上部分的遷移量，來減輕過量Cd對地上部分其他各器官的毒害，從而提高其Cd耐性，與夏漢平和束文圣［20］關于香根草（Vetiveriazizanioides）和百喜草（Paspalumnotatum）抗重金屬的耐性分析是一致的。

值得一提的是，適當處理濃度（100μmol／L）更有利于白三葉對Cd的吸收，濃度過高則加重Cd對植物的毒害，因影響其生理代謝，從而影響植物根對重金屬離子的吸收；而處理濃度過低，因沒有達到植物對重金屬吸收的要求，植株體的重金屬含量也不會達到最大［27］，所以才會出現(xiàn)在400，500μmol／L時，Cd的富集量最多，而二者的TF卻低于100μmol／L。

3．2 Cd2＋脅迫對白三葉葉片細胞結(jié)構(gòu)的影響

隨著脅迫的時間延長，對白三葉的毒害日趨明顯，積累在葉片部分的Cd會使細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損傷［28－29］。白三葉葉肉組織在低Cd2＋條件下結(jié)構(gòu)不受影響，但隨Cd2＋濃度升高，葉肉組織形態(tài)和排列發(fā)生改變。白三葉在高Cd2＋脅迫下葉肉細胞排列疏松，柵欄組織細胞收縮，但海綿組織逐漸退化，利于光合作用產(chǎn)生大量有機酸，同時增加蒸騰作用使Cd大量運輸?shù)饺~片與有機酸結(jié)合，以提高植物對Cd積累能力，這與前人關于重金屬對植物形態(tài)的研究結(jié)果一致［30－32］。高Cd2＋脅迫下葉片上表皮細胞發(fā)生扭曲變形，可能是由于蒸騰作用使Cd在上表皮沉積較多，從徐根娣等［33］的研究中得到證實，這可能是白三葉適應Cd脅迫的一種機制。

3．3 Cd2＋脅迫下白三葉的生理響應

3．3．1 Cd2＋脅迫對葉片光合作用相關指標的影響 已有研究表明，葉綠素含量會隨重金屬的脅迫而下降［34－35］。本試驗中，隨Cd2＋濃度的升高，白三葉葉片的Chl a，Chl b和總?cè)~綠素的含量均降低。其原因可能是Cd2＋脅迫通過干擾α－氨基－γ－酮戊二酸的合成和抑制葉綠素酸酯還原酶的活性，使葉綠素的合成受阻［36－38］。而Cd2＋脅迫對 Chl a／Chl b的影響因植物種類的不同而異。例如：小麥（Triticumaestivum）葉片Chl a／Chl b隨Cd2＋升高而下降［39］，棉花（Gossypiumhirsutum）則增大［40］。低Cd2＋引起白三葉葉片的葉綠素b含量增加，與金山等［41］對白三葉的研究一致，但其機理有待于進一步研究。

3．3．2 Cd2＋脅迫對葉片膜脂過氧化程度的影響 Bowler等［42］指出植物在逆境中，打破活性氧的代謝平衡，從而啟動膜脂質(zhì)過氧化作用或膜脫脂作用，影響膜的功能。Abhay等［43］，Ortega－Villasante等［44］，蘇金為和王湘平［45］，李慧等［46］在對土人參（Talinumpaniculatum）、紫花苜蓿（Medicagosativa）、茶樹苗和草莓的研究中報道：Cd2＋脅迫下，植物體內(nèi)MDA含量急劇增多。本試驗中，MDA含量與Cd2＋濃度間呈極顯著正相關，存在明顯的劑量－效應關系。在低Cd2＋脅迫下，即已出現(xiàn)膜脂過氧化作用，表明白三葉葉片細胞膜對Cd極為敏感，且隨著Cd2＋濃度增加，過氧化作用越來越明顯。

3．3．3 Cd2＋脅迫對葉片抗氧化物酶活力的影響 環(huán)境脅迫會造成植物體內(nèi)活性氧的大量積累，誘導一系列抗氧化反應［47－48］。本試驗中，SOD，POD，CAT三者呈極顯著正相關，低Cd2＋脅迫下，白三葉通過升高SOD，POD和CAT活性來防止活性氧造成的毒害，說明三者發(fā)揮協(xié)同作用，維持植物體內(nèi)氧自由基動態(tài)平衡，體現(xiàn)了白三葉對Cd的適應性；但這種能力是有限度的，在300μmol／L時，白三葉葉片SOD，POD和CAT活性都急劇下降，此時白三葉體內(nèi)活性氧的形成和清除系統(tǒng)之間的平衡被打破。這與劉慧芹等［49］、趙梅等［50］、Weng等［51］關于逆境時植物能通過各抗氧化酶活性協(xié)調(diào)變化來緩解毒害的結(jié)果一致。

重金屬對植物的毒害作用非常復雜，其毒害效應與重金屬種類、重金屬濃度有關，且不同植物也有差異，甚至同一植物的不同器官對重金屬脅迫的反應也存在差異?？梢钥隙ǖ氖?，植物受到重金屬脅迫，細胞結(jié)構(gòu)及生理生化反應等都會受到影響，它們之間相互聯(lián)系和相互制約。今后，可進一步對分子水平的機理進行研究，如信號轉(zhuǎn)導途徑以及分子生物學，充分了解重金屬耐受植物的抗性機理。

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