叢枝菌根真菌對白三葉根系構(gòu)型和糖含量的影響

吳強(qiáng)盛，袁芳英，2，費永俊，李莉，黃詠明，劉春艷

(1.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025;2.京山縣農(nóng)業(yè)局，湖北 荊門431800)

根系構(gòu)型指同一根系中不同類型的根(直根系)或不定根(須根系)在生長介質(zhì)中的空間造型和分布［1］。根系構(gòu)型的優(yōu)劣直接影響植物對土壤養(yǎng)分和水分的吸收，進(jìn)而影響植物的形態(tài)構(gòu)建。根系構(gòu)型最顯著的特點是具有可塑性，受諸多因素的影響，如微生物等［2-4］。目前對根系構(gòu)型的影響因素研究主要關(guān)注生長介質(zhì)的營養(yǎng)狀況以及植物基因型，關(guān)于土壤中的微生物對植物根系構(gòu)型影響的研究甚少。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AM真菌)作為土壤中的一類有益微生物，能夠與大多數(shù)植物根系建立叢枝菌根共生體，其在根外建立的菌絲網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)顯示了許多有益的功能，如促進(jìn)寄主植物養(yǎng)分和水分的吸收，改善寄主植物生長，增強(qiáng)寄主植物的抗逆性，增強(qiáng)草坪植物［如狗牙根(Cynodon dactylon)］刈割后再生能力等［5-6］。已有研究結(jié)果表明，在葡萄(Vitis vinifera)上接種AM真菌聚生球囊霉(Glomus fasciculatum)顯著提高其二級側(cè)根和三級側(cè)根的數(shù)量［7］。然而，接種珠狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita)和地表球囊霉(G.versiforme)對枳實生苗根系的總長度、投影面積、表面積、平均直徑、體積等沒有顯著影響，摩西球囊霉(G.mosseae)和蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)接種還顯著降低了根系總長度、面積和體積［8］。因此，進(jìn)一步通過不同AM真菌種類來驗證其在根系構(gòu)型上的效應(yīng)顯得十分必要。另一方面，根系的生長發(fā)育需要碳水化合物作為能量來源或者反應(yīng)底物，即植物體內(nèi)糖含量變化會影響根系構(gòu)型的優(yōu)劣［9］。而AM真菌也需要消耗4% ～20%的寄主植物光合碳水化合物以維持自身的生長發(fā)育［10］。在這個過程中，AM主要吸收根系的葡萄糖，而不是蔗糖［11］。而根系的碳水化合物主要依賴葉片的蔗糖經(jīng)過韌皮部下運。在AM存在條件下植物葉片和根系蔗糖和葡萄糖含量有何變化，目前還不清楚。此外，在接種AM真菌條件下，植物蔗糖和葡萄糖的根系分配率與植物根系構(gòu)型有正的相關(guān)關(guān)系［12］。因此，進(jìn)一步明確根系構(gòu)型－AM－碳水化合物三者間的關(guān)系，對明白菌根改變根系構(gòu)型至關(guān)重要。

白三葉(Trifolium repens)作為我國廣泛栽培的牧草之一，具有產(chǎn)量高以及再生速度快、匍匐生長等特點，也成為綠地定植的草種之一［13］。在白三葉根際存在許多的有益微生物，如植物根際促生菌、AM真菌等［14］。本研究以白三葉為寄主植物，通過接種不同AM真菌對植株生長、根系構(gòu)型、葉綠素和組織糖含量的變化，探討AM真菌對植物根系構(gòu)型的效應(yīng)及這種效應(yīng)發(fā)生的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為白三葉。供試AM真菌為粘屑多樣孢囊霉(Diversispora spurca)、地表球囊霉(Glomus versiforme)和隱類球囊霉(Paraglomus occultum)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫”(BGC)提供，菌根接種體的形式是感染的高粱(Sorghum vulgare)根段、菌絲、孢子和沸沙的混合物。試驗用盆為塑料盆，規(guī)格是:上口徑16 cm、下內(nèi)徑11 cm、盆高13 cm。盆里預(yù)先裝有高壓蒸氣滅菌(121℃，0.11 MPa，2 h)的黃棕壤與蛭石按照1∶1(體積比)混合基質(zhì)，2010年10月19日進(jìn)行播種，播種前預(yù)先對種子采用70%酒精表面消毒5 min，蒸餾水沖洗3次后，點播于塑料盆基質(zhì)表層0.5 cm處，每盆點播35粒種子，5 d后保留至30株/盆。所有的試驗盆置于PQX人工氣候箱培養(yǎng)，25℃白天/18℃晚上，16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)4個處理，包括接種粘屑多樣孢囊霉、地表球囊霉、隱類球囊霉和不接種叢枝菌根真菌(non-AMF)的對照。接種AM真菌處理的每盆15 g菌劑。每個處理重復(fù)3次，每盆30株白三葉，共12盆，隨機(jī)排列。

1.3 測定方法

在培養(yǎng)箱中經(jīng)過85 d生長后結(jié)束實驗，收獲各個處理的葉片、根系，仔細(xì)地將根系從栽培基質(zhì)中取出，盡可能不傷害根系，用自來水洗凈后，采用EPSON平板掃描儀采集完整的根系圖片，然后對圖片用WinRHIZO根系分析軟件分析根系構(gòu)型參數(shù)，包括長度、投影面積、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)、分支數(shù)和交叉數(shù)。每盆30株三葉草根系均用于根系掃描，30株的根系構(gòu)型參數(shù)平均值作為1次重復(fù)。

從每個處理中隨機(jī)選取15株，于70℃下烘干48 h，然后測定地上部和地下部干重。剩余每盆15株的葉片混合，采用80%丙酮提取，于646和663 nm下比色測定葉綠素含量［15］;部分根系剪成1 cm左右的根段，菌根的染色依次經(jīng)過10%KOH 在90℃透明30 min，10%H2O2漂白10 min，0.2 mol/L HCl酸化10 min，0.05%曲利苯藍(lán)染色10 min［5］，菌根侵染率用菌根侵染的根段長度占檢查根段的總長度的百分?jǐn)?shù)表示。

蔗糖和葡萄糖含量采用比色法［16］進(jìn)行。取50 mg過篩(1 mm)干樣，加入4 mL 80%酒精在80℃水浴40 min，2500 r/min收集上清液，殘渣加4 mL 80%酒精重復(fù)提取1次，合并上清液，其中葉片提取液加入10 mg活性炭于80℃水浴脫色30 min，過濾。等量的酒精提取液與2 mol/L NaOH混合，沸水浴5 min，冷卻，加入30%HCl和0.1%間苯二酚，搖勻，80℃水浴10 min，冷卻后480 nm處比色測定蔗糖含量。取1 mL酶制劑(鄰聯(lián)茴香鹽酸鹽、辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶混合物，pH 5.5)，加入0.5 mL酒精提取液，30℃保溫5 min，然后加入2 mL 10 mol/L H2SO4，于460 nm處比色測定葡萄糖含量。

1.4 統(tǒng)計分析

運用SAS 8.1軟件的ANOVA過程對處理間作差異性測驗，LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AM真菌對白三葉菌根侵染率的影響

從表1可知，3個不同屬的AM真菌都能侵染白三葉根系，菌根侵染率范圍為66.80% ～82.51%，其中G.versiforme對白三葉根系的侵染率最高，且顯著高于其他2個菌種，而D.spurca和P.occultum接種處理間沒有顯著差異。

2.2 不同AM真菌對白三葉生物量的影響

表1還表明，3種AM真菌接種都能顯著地提高白三葉地上部干重、地下部干重、植株總干重，各個菌種處理間也表現(xiàn)顯著差異，其中G.versiforme處理的效果最好，且顯著高于D.spurca和P.occultum的處理，而D.spurca和P.occultum處理間沒有表現(xiàn)顯著差異。此外，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接種處理顯著地抑制了根冠比，分別抑制17%，16%和17%，各個菌種處理間沒有表現(xiàn)顯著差異。

表1 3種AM真菌對白三葉菌根侵染率和生物量的影響(n=3)Table 1 Effects of three AM fungi on mycorrhizal colonization and biomass production of white clover(n=3)

2.3 不同AM真菌對白三葉根系構(gòu)型的影響

圖1顯示，接種AM真菌的白三葉根系構(gòu)型明顯地優(yōu)于未接種AM真菌的對照。表2也顯示，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接種顯著提高白三葉植株根系構(gòu)型參數(shù)如長度、投影面積、表面積、體積、根尖數(shù)(除D.spurca外)、分支數(shù)和交叉數(shù)。在3個AM真菌處理中，以G.versiforme處理的效果最明顯，對根長度、投影面積、表面積、體積、根尖數(shù)、分支數(shù)和交叉數(shù)分別提高44%，42%，38%，42%，86%，57%和56%。但是，所有的AM真菌處理都沒有顯著地改變根系平均直徑。

表2 3種AM真菌對白三葉根系構(gòu)型的影響(n=3)Table 2 Effect of three AM fungi on root system architecture of white clover(n=3)

圖1 接種不同AM真菌的白三葉根系構(gòu)型Fig.1 Root system architecture of white clover plants inoculated with or without AM fungi

2.4 不同AM真菌對白三葉葉綠素以及蔗糖和葡萄糖含量的影響

表3顯示，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum都顯著地提高了白三葉葉綠素含量，分別提高36%，58%和38%，但3個AM真菌處理間沒有顯著差異。

另一方面，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum均顯著地提高了白三葉葉片和根系葡萄糖含量，在葉片中分別提高51%，43%和26%，在根系中提高35%，66%和33%(表3);D.spurca接種的葉片葡萄糖含量顯著高于P.occultum，G.versiforme接種處理的根系葡萄糖含量最高，顯著高于其他2個菌種處理，而D.spurca和P.occultum處理間無差異。接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum也顯著地提高了白三葉葉片蔗糖含量，分別提高54%，32%和16%，3個菌種處理間均存在顯著差異。在根系中，接種D.spurca和P.occultum顯著提高了其蔗糖含量，分別提高了23%和38%，2個菌種處理間無顯著差異;而G.versiforme則顯著降低其蔗糖含量，降低了45%。

表3 3種AM真菌對白三葉葉綠素以及蔗糖和葡萄糖含量的影響(n=3)Table 3 Effects of three AM fungi on chlorophyll，glucose and sucrose contents of white clover(n=3)

3 討論

許多研究已經(jīng)證實，接種AM真菌能夠促進(jìn)植物生長，如株高、莖粗、葉片數(shù)、生物量等［16-17］。本研究也證實，接種D.spurca、G.versiforme和P.occultum能夠顯著提高白三葉的地上部、地下部及植株總干重，其中以G.versiforme的效果最顯著。畢銀麗等［18］研究結(jié)果也表明，生長基質(zhì)施磷肥與否對AM真菌促進(jìn)白三葉生物量效果沒有影響。這種提高一方面與根外菌絲參與水分和養(yǎng)分有關(guān)［19］，另一方面也與接種AM真菌后改善白三葉根系構(gòu)型相關(guān)，因為根系構(gòu)型的改善能夠幫助植物從土壤中吸收更多的礦質(zhì)營養(yǎng)和水分，而增加生物量的效果因AM真菌的種類不同而表現(xiàn)出差異。此外，接種AM真菌降低了白三葉的根冠比，這暗示著叢枝菌根真菌對植株地上部分的促進(jìn)作用大于地下部分。

本研究表明，接種AM真菌的白三葉根系構(gòu)型參數(shù)如長度、投影面積、表面積、體積、根尖數(shù)、分支數(shù)和交叉數(shù)顯著高于不接種AM真菌的對照，其中以G.versiforme處理的效果最明顯，說明AM真菌作為一種有益微生物能夠影響白三葉的根系構(gòu)型，且顯示了促進(jìn)的效應(yīng)。這與Wu等［20］在紅橘(Citrus tangerine)上接種G.mosseae的研究結(jié)果一致。Yao等［8］在枳(Poncirus trifoliata)上接種 G.caledonium、G.intraradices、G.versiforme和 Gigaspora margarita的研究結(jié)果表明，AM真菌沒有顯著改變這些根系構(gòu)型參數(shù)。這暗示了叢枝菌根改善根系構(gòu)型依賴寄主植物和AM真菌兩者的兼容性。AM真菌改善根系構(gòu)型可能與AM真菌誘導(dǎo)根系腐胺合成酶活性正相關(guān)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源多胺代謝，進(jìn)而影響根系構(gòu)型［20］。

AM真菌屬于異養(yǎng)型真菌，需從寄主體內(nèi)獲取碳源，根內(nèi)菌絲主要從根系中吸收己糖，優(yōu)先于葡萄糖，從而在根系建立“菌根碳庫”［10-11］。本研究表明，接種AM真菌顯著提高了白三葉葉片和根系的葡萄糖含量，其中接種G.versiforme的效果最顯著。菌根化植株組織內(nèi)更高的葡萄糖含量為AM的發(fā)育提供了碳源。接種AM真菌的白三葉葉片蔗糖含量顯著高于未接種的對照，根系中的蔗糖含量除接種G.versiforme外，都高于未接種的植株。這充分說明AM存在能夠有利于根系碳庫的積累，特別是葡萄糖。AM真菌通過提高寄主植物(如本研究的三葉草)葉綠素含量，因而改善植物的光合參數(shù)，提高植株葉片光合速率，間接獲得比對照更多的碳水化合物，進(jìn)而改善植物的碳素營養(yǎng)［21］。相關(guān)性分析顯示，白三葉葉片的葡萄糖(r=0.852，P＜0.01)和蔗糖含量(r=0.722，P＜0.01)以及根系葡萄糖含量(r=0.884，P＜0.01)均與菌根侵染率呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步暗示更高的葡萄糖將有利于AM的形成和發(fā)育。在本研究中接種G.versiforme的白三葉根系蔗糖含量低于沒接種的對照，可能是白三葉對G.versiforme的依賴性強(qiáng)(植株生物量和菌根侵染率均最高)，根系中的蔗糖更多地降解成葡萄糖供AM發(fā)育，因而建立最高的菌根侵染率，導(dǎo)致根系蔗糖含量的下降。蔗糖的裂解依賴蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶、中心轉(zhuǎn)化酶、堿性轉(zhuǎn)化酶以及蔗糖合成酶(分解方向)，AM真菌對白三葉蔗糖裂解酶有何影響，還需進(jìn)一步深入研究。

此外，根系的生長和發(fā)育也依賴植物形成的光合碳水化合物，主要以蔗糖為底物［9，22］。這些碳水化合物可直接作為代謝底物或生長調(diào)節(jié)物質(zhì)影響細(xì)胞的分裂，導(dǎo)致根系構(gòu)型發(fā)生變化［23］。在菌根化植物中由于“菌根碳庫”的存在，地上部分的蔗糖經(jīng)長距離運輸向根系的分配比率提高［10］。所以，在菌根化白三葉中接種AM真菌(除G.versiforme外)顯著提高其根系蔗糖的含量。菌根誘導(dǎo)的蔗糖一方面被分解成葡萄糖，供AM的生長發(fā)育，另一方面為根系的發(fā)育提供了代謝底物，有利于根系構(gòu)型的建立。因此，可以推斷，在植物根系中接種AM真菌，能提高寄主植物葉片的蔗糖向地下根系的分配，從而有助于AM的發(fā)育，進(jìn)一步發(fā)揮AM的水分和養(yǎng)分吸收功能，也有利于根系構(gòu)型的建立。

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