山羊瘤胃和糞便中厭氧真菌的分離及發(fā)酵粗飼料能力初探

毛勝勇，姚文，陳勇

（1．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京210095；2．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052）

自O(shè)rpin［1］首次報(bào)道反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)存在有厭氧真菌，迄今為止，已在許多反芻動(dòng)物及單胃草食動(dòng)物的消化道及糞便中分離到多種厭氧真菌，共計(jì)5個(gè)屬10余個(gè)種之多［2］。大量研究表明，瘤胃真菌不僅可以通過(guò)假根以機(jī)械方式刺穿植物細(xì)胞壁，而且可分泌高活性的纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶，并以化學(xué)方式作用于一些難降解的植物組織，如堅(jiān)固的厚壁組織和維管束組織等，提高其消化率［3－4］。瘤胃真菌這種能產(chǎn)生高活性酶的特點(diǎn)，已引起包括酶制劑產(chǎn)業(yè)在內(nèi)的研究人員的廣泛興趣。但要對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究，必須在獲取大量菌種的前提下才能進(jìn)行，而在此方面，目前國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室還是以瘤胃瘺管的方式通過(guò)采集瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行分離，以獲取菌種，這種方式對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能和健康帶來(lái)的嚴(yán)重傷害是顯而易見(jiàn)的，相比而言，以糞便作為菌源來(lái)分離厭氧真菌可消除這些弊端，因而一直為眾多學(xué)者所推崇。但迄今為止，有關(guān)糞便中的厭氧真菌是否具有與瘤胃內(nèi)厭氧真菌相似的降解粗飼料的能力卻未見(jiàn)報(bào)道。為闡明該問(wèn)題，作者分離鑒定了本地（南京郊區(qū)）山羊瘤胃液及其糞便中的厭氧真菌，并以本地（南京郊區(qū)）稻草、麥秸及玉米秸為底物，對(duì)其降解粗飼料的能力進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與培養(yǎng)器材

本實(shí)驗(yàn)于2012年1－12月進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)選用2頭裝有永久性瘤胃瘺管的本地山羊［（25±3．4）kg］。山羊日糧為青干草，單欄飼喂，自由采食與飲水。CO2氣源采用高純度CO2。培養(yǎng)管及發(fā)酵瓶選用特制耐壓玻璃試管，配有丁基膠塞和鋁蓋，密封良好。

1．2 培養(yǎng)基配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基參照Orpin［1］方法配制。其中厭氧真菌分離純化所用液體培養(yǎng)基以1%（w／v）葡萄糖為碳源，配制滾管用的固體培養(yǎng)需加入2%（w／v）的瓊脂。所有培養(yǎng)基均經(jīng)高壓滅菌（121℃，15 min）。

1．3 瘤胃液及糞便的采集與制備

飼喂前1h用真空負(fù)壓裝置采集瘤胃液200mL左右，4層紗布過(guò)濾后置于充滿(mǎn)CO2的發(fā)酵瓶中，而后置于39℃的溫水中；實(shí)驗(yàn)同時(shí)收集新鮮糞便，裝入充滿(mǎn)CO2的發(fā)酵瓶中帶回。

1．4 瘤胃及糞便中厭氧真菌的分離

取瘤胃內(nèi)容物10mL及20g新鮮糞便，分別在含有抗生素（青霉素，1600單位／mL；鏈霉素，1600單位／mL）的液體厭氧培養(yǎng)基中系列稀釋至10－8，用吸液泵于各稀釋度分別吸取7mL注入經(jīng)高壓滅菌（121℃，15min）后的厭氧液體培養(yǎng)管中（稻草濃度為0．5%，40℃預(yù)熱），每稀釋度為3管，將各培養(yǎng)管放入恒溫箱中，39℃培養(yǎng)2周。將制好的固體培養(yǎng)基煮沸融化后置于40℃水浴中，選取在瘤胃及糞便厭氧真菌計(jì)數(shù)期間已用稻草浮起的培養(yǎng)管，用注射器分別吸取0．05，0．10mL的培養(yǎng)液注入液化固體培養(yǎng)基（抗生素濃度與計(jì)數(shù)時(shí)相同）中，迅速搖勻后于冰水中滾管，再放入39℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)3d培養(yǎng)后，用無(wú)菌特制接種針挑取滾管中帶有瓊脂的單個(gè)典型菌落迅速移入5mL液體培養(yǎng)管中（39℃預(yù)熱），39℃下培養(yǎng)3～4d后，再次滾管，如此多次重復(fù)，直至滾管中所有菌落形態(tài)一致。

1．5 厭氧真菌的形態(tài)觀(guān)察

采用倒置顯微鏡，根據(jù)菌絲體形成的孢子囊的個(gè)數(shù)，區(qū)分單中心、多中心真菌的單個(gè)菌落，同時(shí)取典型菌落的培養(yǎng)液置于載玻片上，用相差顯微鏡直接觀(guān)察瘤胃液及糞便中厭氧真菌的菌絲、孢子囊及孢子形態(tài)，照相。

1．6 分離菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

根據(jù)Zhu［5］的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取1．0g粉碎的稻草、麥秸及玉米秸（直徑小于5mm），放入容量為160mL的血清瓶中，厭氧條件下裝入90mL無(wú)氧液體培養(yǎng)基，以丁基塑塞和鋁圈密封，121℃下滅菌15min。試驗(yàn)前，每瓶按預(yù)定比例（青霉素，1600單位／mL；鏈霉素，1600單位／mL）注入抗生素，39℃下預(yù)熱過(guò)夜，每3瓶（3個(gè)重復(fù)）為1個(gè)處理，每處理接種1種已生長(zhǎng)3d的菌種混合懸浮液，接種量為10mL。以不接種厭氧真菌菌液的發(fā)酵瓶為對(duì)照；對(duì)照組的底物與培養(yǎng)基和處理組相同，但對(duì)照瓶注射10mL無(wú)菌厭氧蒸餾水。所有處理和對(duì)照在39℃下靜止培養(yǎng)196h。

1．7 發(fā)酵時(shí)產(chǎn)氣量及發(fā)酵后培養(yǎng)物處理及干物質(zhì)測(cè)定

產(chǎn)氣量測(cè)定參照艾麗霞等［6］的方法。發(fā)酵結(jié)束后，各培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至已稱(chēng)重的過(guò)濾坩鍋，經(jīng)真空抽濾后，放入已預(yù)熱至105℃的烘箱內(nèi)，烘至恒重；而后以對(duì)照作校正，確定稻草、麥秸及玉米秸的降解率。

1．8 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，利用SPSS（15．0）單因子方差分析中LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平置于0．05。

2 結(jié)果與分析

2．1 厭氧真菌的分離鑒定

利用一系列嚴(yán)格的厭氧技術(shù)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分離純化，從山羊瘤胃液中分離到30株厭氧真菌，這些菌歸為4類(lèi)；從糞便中分離到15株厭氧真菌，這些菌株歸屬2類(lèi)；歸類(lèi)參照Ho和Barr［2］厭氧真菌分類(lèi)法。從各類(lèi)菌中選擇具有代表性的菌株，在倒置顯微鏡及常規(guī)光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察所得的菌落、細(xì)胞形態(tài)和菌絲體發(fā)育狀況，結(jié)果分述如下（圖1）。

F1：糞便厭氧真菌。單中心類(lèi)型。菌落呈放射狀，菌絲略有彎曲，較稀疏、有分叉，菌體較大；孢子多為橢圓形，多鞭毛，鞭毛12～14根，孢子在固體培養(yǎng)基中以同心圓狀形式擴(kuò)散開(kāi)來(lái)；孢子囊有球形、橢圓形、圓柱形；囊柄長(zhǎng)，與假根相連，假根系統(tǒng)發(fā)達(dá)，為Neocallimastix屬菌。

F2：糞便厭氧真菌。單中心類(lèi)型。菌落明顯小于F1菌株，菌絲直、密；孢子呈橢圓形或球形，單鞭毛，孢子在固體培養(yǎng)基中以放射狀形式擴(kuò)散開(kāi)來(lái)；孢子囊呈球形，囊柄長(zhǎng)，與假根相連，假根系統(tǒng)不發(fā)達(dá)，為Piromyces屬菌。

R1：瘤胃厭氧真菌。單中心類(lèi)型。菌落呈放射狀，菌絲直、較細(xì)、有分枝、在菌體周?chē)植季鶆?；孢子多為橢圓形，多鞭毛，鞭毛7～8根，成熟孢子囊呈球形；有一明顯的主根與假根相連，假根系統(tǒng)非常發(fā)達(dá)，為Neocallimastix屬菌。

R2：瘤胃厭氧真菌。單中心類(lèi)型。菌落小、無(wú)明顯孢子囊；菌絲稀、較細(xì)、彎曲、有分枝，由中心處生長(zhǎng)多處假根；孢子為橢圓形，多鞭毛，鞭毛5～7根；成熟孢子囊呈球形，有一明顯的主根與假根相連，假根系統(tǒng)較發(fā)達(dá)，為Orpinomyces屬菌。

R3：瘤胃厭氧真菌。單中心類(lèi)型。菌落呈放射狀，菌絲直、有分枝，菌絲中有明顯的主根，且較R1豐富；孢子為圓形，單鞭毛，鞭毛2～4根，成熟孢子囊呈球形；有一明顯“主根”直接與假根相連，由“主根”逐漸分枝，依次形成各級(jí)較細(xì)的假根，為Piromyces屬菌。

R4：瘤胃厭氧真菌。多中心類(lèi)型。孢子球形，單鞭毛，孢子囊未成熟時(shí)橢圓形、球形，成熟孢子囊呈梭形，囊頂端有一尖端突起。菌絲體多分枝，菌絲體有粗細(xì)之分，粗菌絲含多個(gè)細(xì)胞核，菌絲呈分明分節(jié)現(xiàn)象。為Anaeromyces屬菌。

圖1 所分離厭氧真菌菌株的形態(tài)與游動(dòng)孢子形態(tài)Fig．1 The morphology of the isolates or zoospore

2．2 山羊瘤胃及糞便中厭氧真菌對(duì)稻草、麥秸和玉米秸降解能力的比較

選擇上述各屬的代表性菌株進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見(jiàn)表1。瘤胃厭氧真菌株對(duì)上述3種底物的降解能力顯著高于糞便中的厭氧真菌（P＜0．05）。各菌株對(duì)不同底物的降解能力不盡相同，其中4株瘤胃真菌發(fā)酵稻草后的表觀(guān)干物質(zhì)降解率無(wú)顯著差異（P＞0．10）；但R2菌株對(duì)麥秸的降解能力最低，顯著低于其余3株瘤胃真菌（P＜0．05）；R4菌株對(duì)玉米秸的降解能力最低，僅19．6%。各菌株發(fā)酵稻草的總產(chǎn)氣量均值在161～202mL之間，其中以R3的總產(chǎn)氣量最高，F(xiàn)1最低；各菌株發(fā)酵麥秸的總產(chǎn)氣量均值在147～180mL之間，其中以R3的總產(chǎn)氣量為最高，F(xiàn)2最低；各菌株發(fā)酵玉米秸的總產(chǎn)氣量在115～151mL之間，其中以R1的總產(chǎn)氣量為最高，F(xiàn)1最低。

表1 分離菌株對(duì)稻草、麥秸及玉米秸發(fā)酵活力的比較Table 1 The activity of fermentation to the rice straw，wheat straw and corn straw for the isolates

3 討論

由于厭氧真菌的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)信息不足，因而當(dāng)前對(duì)厭氧真菌的分類(lèi)依據(jù)仍主要基于孢子鞭毛數(shù)目、孢子囊形態(tài)、菌絲和孢子囊柄的特征，而這種分類(lèi)法一般僅能鑒定到屬，因而本文對(duì)所分離的厭氧真菌僅鑒定到屬［7－8］。Theodorou等［9］從荷斯坦奶牛糞便中分離所得的厭氧真菌皆屬單中心厭氧真菌，主要包括Neocallimastix、Piromyces和Caecomyces屬。Orpin和Joblin［10］從山羊瘤胃也分離到類(lèi)似于Neocallimastix、Piromyces、Orpinomyces菌株。Ho等［11］從山羊瘤胃內(nèi)分離到一株P(guān)iromycesspiralis。本試驗(yàn)從飼喂青干草的山羊糞便中分離到2類(lèi)厭氧真菌，皆為單中心，歸屬Neocallimastix和Piromyces，從瘤胃液中分離到4類(lèi)厭氧真菌，分屬Neocallimastix、Piromyces、Orpinomyces和Anaeromyces。各厭氧真菌的生長(zhǎng)特性、孢子鞭毛數(shù)目、孢子囊形態(tài)、菌絲和孢子囊柄的特征基本與上述報(bào)道相似。

厭氧真菌對(duì)底物的降解能力除與菌株本身有關(guān)外，還受培養(yǎng)條件、發(fā)酵底物等多種因素的影響。對(duì)菌株自身而言，厭氧真菌的來(lái)源及地區(qū)性能影響厭氧真菌降解底物植物片段的能力［5，12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從糞便中分離到的厭氧真菌對(duì)稻草、麥秸及玉米秸的降解率皆低于從瘤胃中分離所得的厭氧真菌，該結(jié)果也進(jìn)一步佐證了上述報(bào)道。其原因可能在于瘤胃真菌處于高度競(jìng)爭(zhēng)的瘤胃微生態(tài)環(huán)境中，一直保持著較強(qiáng)的活力，而糞便中厭氧真菌孢子處于休眠期，活力相對(duì)較弱，這種活力上的不同也最終導(dǎo)致兩者在發(fā)酵底物能力上的相異。本研究表明，分離所得的厭氧真菌對(duì)不同底物的降解率不一致，這種不一致可能與底物的結(jié)構(gòu)組成及菌株自身分泌的酶類(lèi)型有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所有3種底物中，玉米秸的木質(zhì)素含量最高。而有報(bào)道表明，厭氧真菌發(fā)酵不同底物時(shí)分泌的多糖降解酶的活性與菌株本身及底物種類(lèi)有關(guān)［13］。同時(shí)其他報(bào)道也表明，許多多糖降解酶的分泌量取決于其基因型與底物組成兩方面因素［14］。因而當(dāng)同一株厭氧真菌發(fā)酵不同底物時(shí)，其產(chǎn)生的降解該底物的酶的活力與數(shù)量不一致，由此出現(xiàn)本研究中所觀(guān)察到的同一株厭氧真菌對(duì)不同底物的降解能力不一致的現(xiàn)象。

綜上所述，本研究從山羊瘤胃與糞便中分離獲得4類(lèi)厭氧真菌，所獲菌株對(duì)稻草具有較強(qiáng)的降解能力，但對(duì)玉米秸的降解能力較低。但由于本研究主要側(cè)重于這些菌株的分離報(bào)道與發(fā)酵粗飼料能力的初步探索，這些菌株的酶學(xué)特性及其基因組信息等尚需進(jìn)一步研究。

［1］Orpin C G．Studies on the rumen flagellateNeocallimastixfrontalis［J］．Journal of General Microbiology，1975，91：249－262．

［2］Ho W Y，Barr S J D．Classification of anaerobic gut fungi from herbivored with emphasis on rumen fungi from Malaysia［J］．Mycologia，1995，87（5）：655－677．

［3］Akin D E，Borneman W S，Lyon C E．Degradation of leaf blades and stems by monocentric and polycentric isolates of ruminal fungi［J］．Animal Feed Science and Technology，1995，31：205－221．

［4］Borneman W S，Hartley R D，Morrison W H，etal．Feruloyl and P－coumaroyl esterase from anaerobic fungi in relation to plant cell wall degradation［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，1990，33：345－351．

［5］Zhu W Y．Growth and survival of anaerobic fungi in batch culture and continuous－flow culture［J］．Anaerobe，1996，2：29－37．

［6］艾麗霞，蘇勇，朱偉云．梅山與長(zhǎng)白母豬糞樣微生物體外發(fā)酵八種纖維底物的特性比較［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（3）：99－107．

［7］Theodorou M K，Gill M，King－Spooner C，etal．Enumeration of anaerobic chytridiomycetes as thallus forming units：a novel method for the quantification of fibrolytic fungal populations from the digestive tract ecosystem［J］．Applied and Environmental Microbiology，1990，56：1073－1078．

［8］Davies R D，Theodorou M K，Lawrence M I G．Distribution of anaerobic fungi in the digestive tract of cattle and their survival in faeces［J］．Journal of General Microbiology，1993，139：1395－1400．

［9］Theodorou M K，Davies R D，Jordan C G，etal．Comparision of anaerobic fungi in faeces and rumen digesta of newly born and adult ruminants［J］．Mycology Research，1993，97（10）：1245－1252．

［10］Orpin C G，Joblin K N．The Rumen Microbial Ecosystem （2nd ed．）［M］．London：Elsevier Applied Science Press，1988．

［11］Ho Y W，Abdullah N，Jalaludin S．Piromycesspiralis，a new species of anaerobic fjungus from the rumen of goat［J］．Mycotaxon，1993，48：59－68．

［12］Borneman W S，Akin D E，Ljungdahl L G．Fermentation products and plant cell wall degrading enzymes produced by monocentric and polycentric anaerobic ruminal fungi［J］．Applied and Environmental Microbiology，1989，55：1066－1073．

［13］Ho Y W，Wong N，Abdullah H，etal．Fermentation activities of some new species of anaerobic rumen fungi from Malaysia［J］．Journal of General Microbiology，1996，42：51－59．

［14］William A G，Orpin C G．Polyxaccharide degrading enzymes formed by three species of anaerobic rumen fungi grow on a range of carbohydrate substrates［J］．Canadian Journal of Microbiology，1987，33（5）：418－426．