雙單倍體牙鲆的性腺發(fā)生、性別分化及早期發(fā)育的研究

王桂興，朱以美，侯吉倫，張曉彥，王玉芬，孫朝徽，姜秀鳳，劉海金

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北秦皇島066100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141)

1 前言

牙鲆（Paralichthys olivaceus）肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，同時(shí)它還具有生長(zhǎng)快、繁殖能力強(qiáng)、洄游性小和回歸性強(qiáng)的特點(diǎn)，是中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家重要的海水增養(yǎng)殖魚類[1]。牙鲆雌雄個(gè)體差異較大，雌魚的生長(zhǎng)速度明顯快于雄魚。人工養(yǎng)殖條件下這種差異更加顯著。在生產(chǎn)中，養(yǎng)殖全雌牙鲆比養(yǎng)殖普通牙鲆能大幅度提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，從而獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益。因此，人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育，實(shí)現(xiàn)牙鲆養(yǎng)殖全雌化，對(duì)提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益具有非常重要的意義[2]。根據(jù)不同的處理原理，雌核發(fā)育可分為減數(shù)分裂雌核發(fā)育和有絲分裂雌核發(fā)育。有絲分裂雌核發(fā)育能夠產(chǎn)生雙單倍體，再次誘導(dǎo)雌核發(fā)育，即可獲得克隆牙鲆。

從20世紀(jì)60年代以來，我國(guó)學(xué)者對(duì)魚類性腺發(fā)育的研究有許多報(bào)道，多數(shù)集中在性腺發(fā)育的分期和季節(jié)變化規(guī)律方面，直到現(xiàn)在許多學(xué)者還在致力于此方面的研究。但是，對(duì)魚類性別分化的研究較少，且大多集中在淡水魚類，而對(duì)海水魚類的研究則更少[3，4]。關(guān)于雙單倍體牙鲆的性腺發(fā)生、分化及發(fā)育的研究，至今未見報(bào)道。

本文對(duì)雙單倍體牙鲆的性腺發(fā)生、性別分化及早期發(fā)育過程進(jìn)行組織切片觀察，對(duì)其性比及性腺組織學(xué)特征進(jìn)行了描述和分析，旨在為研究雙單倍體牙鲆的繁殖生物學(xué)提供組織學(xué)上的依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)的親魚取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，是2007年生產(chǎn)的普通牙鲆，5齡，體質(zhì)量為4.17 kg，全長(zhǎng)70 cm。利用親魚的同一批卵子，誘導(dǎo)有絲分裂雌核發(fā)育、減數(shù)分裂雌核發(fā)育和對(duì)照組。有絲分裂雌核發(fā)育，用紫外線滅活的真鯛精液激活卵子，靜置3 m in后加入17℃海水培育60min，然后轉(zhuǎn)移至靜水壓機(jī)（5406R，大岳公司，日本）中，施壓650MPa，持續(xù)6m in，完成雌核發(fā)育誘導(dǎo)后，移至常溫海水中孵化。減數(shù)分裂雌核發(fā)育，用紫外線滅活的真鯛精液激活卵子，靜置3m in后轉(zhuǎn)入0℃海水中培育30m in，然后移至常溫海水中孵化。對(duì)照組為精卵通過干法受精方式獲得。受精卵分別培育在0.5m3的孵化缸中，開始培育水溫16℃。30天后轉(zhuǎn)入3m3的大孵化缸中培育，采用常規(guī)方法進(jìn)行培育，投喂餌料依次是輪蟲、鹵蟲和配合餌料。

2.2 性別分化樣品的采集

初孵仔魚自孵出后第10天開始取樣，10～80天，每5天隨機(jī)取樣5尾；80～110天，每10天隨機(jī)取樣5尾。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別取樣，每組分別取樣90尾。對(duì)所取樣品進(jìn)行稱重和照相。分別取頭尾放于波恩試液中固定12 h，之后存放在濃度為70%的酒精中。

2.3 性腺發(fā)育樣品的采集

性別分化110天后，每月隨機(jī)取樣5～10尾，至18月齡結(jié)束。由于有絲分裂雌核發(fā)育牙鲆特別珍貴，所以筆者在保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行并能充分說明所要研究問題的同時(shí)取樣較少。對(duì)所取樣品進(jìn)行稱重和照相。取性腺的前、中、后部放于波恩試液中固定24 h，之后存放在濃度為70%的酒精中。

2.4 組織切片

將固定好的樣品用70%的酒精沖洗，然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟（熔點(diǎn)為56～58℃）包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。采用蘇木素-伊紅（H.E）染色，中性樹膠封片。組織切片用Leica光學(xué)顯微鏡觀察并顯微攝影。

2.5 組織切片觀察方法

本文將牙鲆性腺分化的組織學(xué)特征卵巢腔的形成作為雌性性別分化開始的依據(jù)，沒有觀察到其他研究者看到的輸精管原基，把沒有卵巢腔形成的認(rèn)為是精巢。以Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞的出現(xiàn)作為卵巢分化完成的標(biāo)志；而以精巢中初級(jí)精母細(xì)胞的出現(xiàn)作為精巢分化完成的標(biāo)志。觀察有絲分裂雌核發(fā)育牙鲆的性腺分化與普通牙鲆的性腺分化的不同，包括性別分化開始時(shí)間、性別分化完成時(shí)間、卵原細(xì)胞的數(shù)目和精原細(xì)胞的數(shù)目等。

本文以施瑔芳等[5]提出的劃分標(biāo)準(zhǔn)和劉筠[6]提出的劃分標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，結(jié)合張耀光等[7]的觀點(diǎn)，并依據(jù)牙鲆卵母細(xì)胞及精母細(xì)胞自身發(fā)育的特點(diǎn)，劃分牙鲆卵母細(xì)胞時(shí)相及精巢的分期。卵巢發(fā)育分期依卵巢切面中所占面積超過50%或比例最高的卵母細(xì)胞的時(shí)相進(jìn)行劃分。比較有絲分裂雌核發(fā)育與普通牙鲆性腺發(fā)育的不同，包括各個(gè)時(shí)期卵母細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)、細(xì)胞質(zhì)的不同、細(xì)胞核的不同及數(shù)目，以及精巢中各個(gè)時(shí)期精小葉、精小囊的形態(tài)特點(diǎn)、精原細(xì)胞的數(shù)目以及初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞的數(shù)目等。

3 結(jié)果與分析

3.1 雙單倍體牙鲆原始性腺的發(fā)生

普通牙鲆15～35日齡的仔魚，全長(zhǎng)8.3～17.9mm，腹腔后端向腹腔內(nèi)形成突起并逐漸延伸，形成生殖嵴；隨著日齡增大，全長(zhǎng)增加，生殖嵴內(nèi)原始生殖細(xì)胞（PGCs）數(shù)目增加，35日齡時(shí)增加到5～6個(gè)，位于中腎管附近，與生殖嵴共同構(gòu)成性腺原基；原始生殖細(xì)胞體積大，要比正常的體細(xì)胞大很多，細(xì)胞核被染成紫色，核染色較深，胞質(zhì)著色較淺，細(xì)胞界限明顯。35～45日齡，仔魚全長(zhǎng)17.9～27.4mm，性腺長(zhǎng)度前期增加，后期變化不大，但是明顯變寬，原始生殖細(xì)胞數(shù)量增加，排列變得稍微緊密，細(xì)胞直徑變大；45日齡時(shí)，性腺內(nèi)出現(xiàn)微血管。此時(shí)仍不能分清精巢或卵巢，隨后，性腺進(jìn)入分化階段。減數(shù)分裂雌核發(fā)育牙鲆原始性腺的發(fā)生和普通牙鲆基本相同。

雙單倍體牙鲆30～40日齡的仔魚，全長(zhǎng)10～21mm，原始生殖細(xì)胞由1個(gè)增加到4個(gè)。分布在生殖嵴內(nèi)，兩者共同構(gòu)成性腺原基，性腺呈長(zhǎng)條狀，向腹腔內(nèi)延伸。40～55日齡，仔魚完成變態(tài)，全長(zhǎng)21～38mm，性腺繼續(xù)延伸變寬，原始生殖細(xì)胞數(shù)量增加，在性腺內(nèi)部排列逐漸緊密，原始生殖細(xì)胞逐漸增大；55日齡時(shí)，性腺內(nèi)出現(xiàn)微血管，但仍不能辨別雌雄（見圖1）。

圖1 30～55日齡雙單倍體牙鲆的原始性腺Fig.1 Primordial gonad of 30～55 day sold doubled haploid Paralichthy solivaceus

3.2 雙單倍體牙鲆的性別分化

3.2.1 卵巢的分化

普通牙鲆50日齡，全長(zhǎng)41.2mm，性腺有像卵巢發(fā)育的跡象，中間出現(xiàn)卵巢腔，一端向另一端延伸，最后兩端逐漸靠近，閉合后中間形成腔隙；背側(cè)基部有微血管。60日齡，全長(zhǎng)50mm，卵原細(xì)胞增多，排列在性腺的邊緣，血管增多。70日齡，全長(zhǎng)86.8 mm，性腺一端逐漸卷曲延伸，形成產(chǎn)卵板，卵原細(xì)胞沿著產(chǎn)卵板緊密排列。80日齡，全長(zhǎng)92.5 mm，卵原細(xì)胞繼續(xù)增多，細(xì)胞體積逐漸變大，形成向卵母細(xì)胞過渡的細(xì)胞，繼續(xù)卷曲延伸形成產(chǎn)卵板，卵巢腔未閉合。90日齡，全長(zhǎng)114mm，個(gè)別開始出現(xiàn)Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞，細(xì)胞體積變大，含有2～3個(gè)核仁，分布于核周邊，細(xì)胞質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，沿卵母細(xì)胞邊緣均勻分布。100日齡，全長(zhǎng)135.7 mm，大部分卵巢都出現(xiàn)Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞，同時(shí)細(xì)胞數(shù)目增多，至此，卵巢分化完成，屬于Ⅰ卵巢。卵巢腔形成是卵巢分化的標(biāo)志，Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞的出現(xiàn)是卵巢分化完成的標(biāo)志。減數(shù)分裂雌核發(fā)育牙鲆卵巢的分化和普通牙鲆基本相同。

雙單倍體牙鲆60日齡，全長(zhǎng)47mm，性腺開始向卵巢發(fā)育，一端向另一端卷曲延伸，中間形成腔隙，慢慢閉合形成卵巢腔；有微血管出現(xiàn)（見圖2a）。70日齡，全長(zhǎng)64.2mm，性腺一端繼續(xù)延伸，形成產(chǎn)卵板，卵原細(xì)胞沿著邊緣分布，血管增多（見圖2b）。80日齡，全長(zhǎng)87.3mm，產(chǎn)卵板數(shù)目逐漸增多，卵原細(xì)胞數(shù)量也增加，同時(shí)細(xì)胞的體積增大，逐漸向過渡細(xì)胞轉(zhuǎn)變，細(xì)胞沿著產(chǎn)卵板分布。90日齡，全長(zhǎng)104mm，產(chǎn)卵板和卵原細(xì)胞數(shù)目都繼續(xù)增多，在產(chǎn)卵板上緊密排列。細(xì)胞體積也進(jìn)一步增大（見圖2c）。100日齡，全長(zhǎng)122mm，產(chǎn)卵板數(shù)目繼續(xù)增加，但卵巢腔仍未閉合，未見Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞出現(xiàn)（見圖2d）。110日齡，全長(zhǎng)132mm，產(chǎn)卵板上存在大量的卵原細(xì)胞向卵母細(xì)胞過渡的細(xì)胞，但仍未見有Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞出現(xiàn)（見圖2e）。

圖2 60～110日齡雙單倍體牙鲆的卵巢Fig.2 Ovary of 60～110 day sold doubled haploid Paralichthys olivaceus

3.2.2 精巢的分化

雙單倍體牙鲆和普通牙鲆在精巢分化時(shí)間上基本相同。全長(zhǎng)42.6～51.5mm、55日齡的幼魚中，沒有出現(xiàn)卵巢腔裂隙的那一類型的性腺則沒有明顯變化，整個(gè)性腺呈長(zhǎng)條狀（見圖3a）。筆者認(rèn)為像這樣沒有變化的性腺將發(fā)育成精巢。60～80日齡，全長(zhǎng)55～87mm，精巢繼續(xù)延伸、變寬，精原細(xì)胞有所增加（見圖3b）。90日齡，全長(zhǎng)100mm，精原細(xì)胞聚集成簇，形成囊狀結(jié)構(gòu)，將會(huì)發(fā)展成為精小葉，精小葉間基質(zhì)內(nèi)有微血管分布，精原細(xì)胞數(shù)目大量增加（見圖3c）。100日齡，全長(zhǎng)122mm，精巢內(nèi)精小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞，還有少量次級(jí)精母細(xì)胞，標(biāo)志著性腺分化完成（見圖3d）。

3.3 雙單倍體牙鲆的性腺發(fā)育

3.3.1 卵巢的發(fā)育

牙鲆具有一對(duì)卵巢，呈圓錐狀，一般情況下呈左右對(duì)稱狀分布。但是在雙單倍體牙鲆中，卵巢經(jīng)常出現(xiàn)不對(duì)稱分布的情況，形態(tài)包括：缺少一邊，只剩左支；性腺一端彎曲折疊；性腺左右兩端一大一小等。牙鲆左右卵巢各延伸出一條輸卵管，在臨近生殖孔處匯合，并開口于生殖孔。根據(jù)卵巢發(fā)育過程中生殖細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化及特點(diǎn)將其分為以下幾個(gè)時(shí)期。

1）Ⅰ期，3～5月齡，卵巢內(nèi)的細(xì)胞主要由卵原細(xì)胞、Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞以及由卵原細(xì)胞向Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞過渡的細(xì)胞組成。卵原細(xì)胞小且圓，細(xì)胞質(zhì)區(qū)域顯著，核仁明顯，細(xì)胞聚集成團(tuán)。卵原細(xì)胞不斷增值。Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞原生質(zhì)和細(xì)胞核開始增大，細(xì)胞質(zhì)被蘇木素染成淡紫色，核膜界線清晰，核膜邊緣有1～3個(gè)染色很深的核仁，觀察到核質(zhì)內(nèi)有絲狀的物質(zhì)，似染色體殘跡。過渡的細(xì)胞其細(xì)胞直徑介于卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間，由卵原細(xì)胞緩慢過渡到卵母細(xì)胞。

圖3 55～110日齡雙單倍體牙鲆的精巢Fig.3 Testisof 55～110 daysold doubled haploid Paralichthys olivaceus

2）Ⅱ期，6～18月齡，根據(jù)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞直徑、油球、生長(zhǎng)環(huán)和卵黃核的出現(xiàn)，以及核仁數(shù)目的變化，將Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞劃分為早、中、晚3個(gè)時(shí)期。6～10月齡的卵巢為早期卵巢，與Ⅰ期相比，卵母細(xì)胞體積增大，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)區(qū)域增大，被蘇木素染成深紫色，靠近核膜處出現(xiàn)油球，在細(xì)胞核邊緣分布3～6個(gè)大核仁不等。11月齡的卵巢為早期向中期過渡的卵巢，可見卵母細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，核質(zhì)比變小，核仁數(shù)目增加，油球數(shù)目增加，并聚集成塊，個(gè)別卵母細(xì)胞出現(xiàn)卵黃核，正向Ⅱ期中期過渡。12～16月齡的卵巢為中期卵巢，卵母細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，在性腺中排列緊密，成不規(guī)則形狀，油球數(shù)目增多，沿著細(xì)胞核周圍分層排列，部分卵母細(xì)胞、油球在靠近細(xì)胞質(zhì)外緣圍成一圈，把細(xì)胞質(zhì)分成內(nèi)外兩層；核仁數(shù)目增加，核仁與前期相比變小，數(shù)目增加至7～20個(gè)不等，細(xì)胞核中間出現(xiàn)似染色質(zhì)的物質(zhì)，呈團(tuán)狀，個(gè)別有卵黃核出現(xiàn)。18月齡為中期向晚期過渡階段，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，呈橢圓形或不規(guī)則形狀，油球繼續(xù)增多，分層聚集成塊，細(xì)胞質(zhì)染色出現(xiàn)分層現(xiàn)象，靠近卵核處染成淺紫色，而靠近卵膜處染成深紫色；核仁排列在細(xì)胞核的邊緣，數(shù)目增加，出現(xiàn)卵黃核。

與普通牙鲆相比，雙單倍體牙鲆的Ⅰ期卵巢發(fā)育過程沒有差異，3～5月齡卵巢內(nèi)的細(xì)胞主要由卵原細(xì)胞、Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞以及由卵原細(xì)胞向Ⅰ時(shí)相卵母細(xì)胞過渡的細(xì)胞組成（見圖4a）。

普通牙鲆的Ⅱ期卵巢，6～17月齡，同樣根據(jù)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞直徑、油球、生長(zhǎng)環(huán)和卵黃核的出現(xiàn)，以及核仁數(shù)目的變化，將Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞劃分為早、中、晚3個(gè)時(shí)期。6～9月齡為早期，卵母細(xì)胞體積增大，細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，在近核膜處出現(xiàn)油球，在核膜邊緣分布3～6個(gè)不等的大核仁。10～12月齡為中期，卵母細(xì)胞的體積進(jìn)一步增大，在性腺中排列緊密，呈不規(guī)則形狀，油球數(shù)目增多，沿著細(xì)胞核周圍分層排列，部分卵母細(xì)胞、油球在靠近細(xì)胞質(zhì)外緣圍成一圈，把細(xì)胞質(zhì)分成內(nèi)外兩層。核仁數(shù)目增加至7～17個(gè)。細(xì)胞質(zhì)染色出現(xiàn)分層現(xiàn)象，靠近細(xì)胞核部分染色較淺，而靠近核膜處染色較深。13～18月齡為晚期，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，呈不規(guī)則多角形，出現(xiàn)卵黃核，卵黃核周圍細(xì)胞質(zhì)被溶解，核仁數(shù)量增加，核膜模糊。

圖4 雙單倍體牙鲆卵巢的發(fā)育Fig.4 Ovary development of doubled haploid Paralichthy solivaceus

雙單倍體牙鲆卵巢中發(fā)育異常的卵母細(xì)胞主要是形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變：a.通過各個(gè)時(shí)期雙單倍體牙鲆性腺與普通牙鲆性腺的對(duì)比，性腺中的嗜堿性細(xì)胞增多，不見細(xì)胞核，只見一個(gè)個(gè)被染成深紫色的細(xì)胞；b.細(xì)胞核中出現(xiàn)不規(guī)則的嗜堿性結(jié)構(gòu)，中空的U形結(jié)構(gòu)；c.細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，表現(xiàn)為內(nèi)外兩層，且相互分離，內(nèi)層染色深，外層染色淺，內(nèi)層聚集成團(tuán)，看不清內(nèi)部結(jié)構(gòu)；d.退化的卵巢，能看到卵巢腔和產(chǎn)卵板的結(jié)構(gòu)，分布著極少量血管和細(xì)胞，沒有卵母細(xì)胞，因此不能分清發(fā)育到哪期，筆者把這類卵巢叫做退化卵巢；e.敗育的卵巢，能看到卵巢腔和產(chǎn)卵板的結(jié)構(gòu)，性腺組織被染成紅色，有非常少的血管分布，不見任何細(xì)胞，故稱此類卵巢為敗育卵巢（見圖4f～圖4h）。

3.3.2 精巢的發(fā)育

牙鲆精巢位于體腔后緣、中腎后方，與中腎相連，根據(jù)精巢發(fā)育過程中生殖細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化及特點(diǎn)將其分為以下幾個(gè)時(shí)期。

1）Ⅰ期，與普通牙鲆發(fā)育時(shí)期及特點(diǎn)相同，2～3月齡，精巢形成許多精小葉，每個(gè)精小葉內(nèi)鑲嵌2～4個(gè)精原細(xì)胞，小葉基質(zhì)中有微血管。精原細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核大，位于中央或邊緣，細(xì)胞質(zhì)染色淺，在其一生中Ⅰ期精巢僅出現(xiàn)一次。

2）Ⅱ期，與普通牙鲆發(fā)育時(shí)期及特征也沒明顯差異，4～5月齡，精小葉略顯增大，小葉間結(jié)締組織增多，精原細(xì)胞數(shù)目迅速增加，緊密排列于精小葉中，處于增值期；并出現(xiàn)少量初級(jí)精母細(xì)胞，初級(jí)卵母細(xì)胞與精原細(xì)胞相比，體積變小，細(xì)胞核染色深。

3）Ⅲ期，6～11月齡，精小葉體積增大，精小葉間結(jié)締組織變薄。早期，6月齡，精小葉內(nèi)充滿了精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，以及少量次級(jí)精母細(xì)胞；中期，7～8月齡，可見含有大量初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞的精小囊，還有少量精子細(xì)胞；末期，9～11月齡，可見精子細(xì)胞增多，同時(shí)含有大量的初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞，精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞沿著精小葉邊緣分布，此期為向Ⅳ期精巢過渡階段。初級(jí)精母細(xì)胞的體積小于精原細(xì)胞，次級(jí)精母細(xì)胞的體積小于初級(jí)精母細(xì)胞，由初級(jí)精母細(xì)胞分裂而來；精子細(xì)胞的體積小于次級(jí)精母細(xì)胞，由次級(jí)精母細(xì)胞分裂而來?？梢钥吹?，精原細(xì)胞分布在精小葉的邊緣，精小葉內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育是不同步的，而精小囊內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育是同步的。與普通牙鲆相比，雙單倍體牙鲆Ⅲ期精巢發(fā)育較慢，普通牙鲆性腺在同期進(jìn)入了Ⅳ期，主要特征就是精小葉間結(jié)締組織變薄，精小葉內(nèi)充滿大量正在變態(tài)的精子細(xì)胞和精子，以及大量的初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞，精小葉之間相互連通或貫穿（見圖5a和圖5b）。

圖5 雙單倍體牙鲆精巢的發(fā)育Fig.5 Testis development of doubled haploid Paralichthy solivaceus

11月齡，觀察到其中1尾雙單倍體牙鲆精巢有退化的趨勢(shì)，精子細(xì)胞與前期相比減少，精小葉內(nèi)含有大量的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞（見圖5c）。

13～15月齡，雙單倍體牙鲆與普通牙鲆差別很大，精巢發(fā)生退化（見圖5d）。13月齡的主要特征是次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞消失，精小葉內(nèi)被大量的精原細(xì)胞及少量的初級(jí)精母細(xì)胞填充。其中有1尾發(fā)育正常的雙單倍體牙鲆，特征是精小葉內(nèi)出現(xiàn)空腔，此空腔應(yīng)該是精子排出以后殘留的，還含有大量的精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞以及少量的次級(jí)精母細(xì)胞。14～15月齡的主要特征是精小葉內(nèi)只含有精原細(xì)胞，初級(jí)精母細(xì)胞消失不見，似Ⅱ期精巢（見圖5e和圖5f）。

16～18月齡，部分雙單倍體牙鲆精巢發(fā)育正常，精小葉中出現(xiàn)空腔，似是精子排出后留下的，同時(shí)還含有大量精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，以及少量的次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞（見圖5g）。但此期并不完全像排出精子后的精巢，普通牙鲆精子排出后，精小葉萎縮，只含有殘存的精子、精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，特征與所觀察到雙單倍體牙鲆性腺有差距。此外，還有部分精巢仍處于退化階段。

18月齡，觀察到1尾雙單倍體牙鲆精巢敗育，從切片可以看出精小葉結(jié)構(gòu)以及精小葉內(nèi)出現(xiàn)很多空腔，但是觀察不到任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也就是說沒有精原細(xì)胞，故稱此類精巢為敗育精巢（見圖5h）。

4 討論

4.1 雙單倍體牙鲆的性比

牙鲆的性別決定機(jī)制是XX-XY型，在XX-XY性別決定的魚類中，雌核發(fā)育后代預(yù)期是全雌的。本研究中，在79尾實(shí)驗(yàn)魚中，雌魚44尾，占群體總數(shù)的55.7%；雄魚30尾，占群體總數(shù)的37.9%；雌雄魚比例為1∶0.68，與預(yù)測(cè)結(jié)果存在很大的偏差。導(dǎo)致該結(jié)果的原因一部分可能歸結(jié)于環(huán)境因素壓制了性別決定體系，還有一些實(shí)驗(yàn)表明隱性突變影響性別決定。雙單倍體出現(xiàn)雄性的例子有很多，雙單倍體斑馬魚主要是雄魚，甚至是雙單倍體雌魚誘導(dǎo)雌核發(fā)育都能生產(chǎn)全雄的克隆系[8，9]。斑馬魚中這種異常的性比似乎是一個(gè)重要的事實(shí)，所有的動(dòng)物開始都發(fā)育成雌魚，而后會(huì)有一部分波動(dòng)比例改變性別變成雄魚[10]。尼羅羅非魚的性別決定是XXXY型[11]，但是可能受溫度的影響[9，12]，雙單倍體中出現(xiàn)較高的雄魚比例，比例高達(dá)35.3%。Müller-Belecke和H?rstgen-Schwark[9]認(rèn)為存在1～2個(gè)較小的性別決定因素，當(dāng)這幾個(gè)性別決定因素發(fā)生在純合子狀態(tài)時(shí)可能推翻XX-XY機(jī)制。Sarder等[13]認(rèn)為在雙單倍體出現(xiàn)雄魚的這些群體中存在不止一個(gè)較小的性別決定位點(diǎn)的分離。Karayücel等[14]發(fā)現(xiàn)在尼羅羅非魚中存在著一個(gè)能引起雌魚變?yōu)樾埕~的性逆轉(zhuǎn)基因，且此基因和控制紅色體色的基因相關(guān)聯(lián)。魚類的性別決定是個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，不僅受遺傳影響，還與其所在環(huán)境、行為和生理因素等有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)雙單倍體牙鲆中出現(xiàn)雄性的原因進(jìn)行說明，因此還需設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)生的原因進(jìn)行研究。

4.2 雙單倍體牙鲆的性腺分化

多數(shù)魚類的性腺分化不僅與日齡相關(guān)，還與全長(zhǎng)密切相關(guān)。日齡越大，全長(zhǎng)越長(zhǎng)，性腺發(fā)育越明顯。不同魚種性腺分化時(shí)間差別很大，同一種魚的性腺分化時(shí)間也可能不同，Yamamoto[15]報(bào)道牙鲆性腺分化的全長(zhǎng)是27～37mm；而Tabata[16]報(bào)道的全長(zhǎng)為30～100mm；孫鵬等[17]報(bào)道的全長(zhǎng)為38mm；孫朝徽[18]報(bào)道的全長(zhǎng)為33.8mm。本研究普通牙鲆全長(zhǎng)41mm時(shí)才開始向卵巢分化，而雙單倍體牙鲆全長(zhǎng)47mm時(shí)才開始分化。這可能是誘導(dǎo)處理和培育水溫不同導(dǎo)致的。本研究觀察到雙單倍體牙鲆與普通牙鲆的性腺分化時(shí)間有差異，但是并未找到出現(xiàn)這種現(xiàn)象的具體原因，還需設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行具體的觀察研究。

4.3 雙單倍體牙鲆性腺的退化及敗育

本研究中，觀察到精巢退化的現(xiàn)象。該現(xiàn)象可能是隱性有害基因純合并表達(dá)引起的，可能是單基因控制，可能由多基因共同決定，也可能與Y染色體的缺失有關(guān)。本研究的結(jié)果與周丹[2]研究的結(jié)果相似。筆者并未對(duì)其產(chǎn)生的原因進(jìn)行研究，還需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。同時(shí)，觀察到1尾雙單倍體牙鲆精巢敗育。造成精巢敗育的原因可能與隱性有害基因的純合或Y染色體的缺失有關(guān)，也可能是兩者共同決定的。由于此類精巢數(shù)目很少，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證及研究。

本研究中，觀察到一尾雙單倍體牙鲆卵巢退化和一尾雙單倍體牙鲆卵巢敗育。由于所觀察的此兩類卵巢數(shù)目很少，而且在其他魚類中也沒有此種現(xiàn)象的報(bào)道，所以筆者分析造成這種現(xiàn)象的原因可能與基因純合并表達(dá)有關(guān)，也可能是由于突變基因的影響，還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。

[1] 安泉泉.雙單倍體牙鲆(Paralichthys olivaceus)與骨骼生長(zhǎng)相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[D].上海：上海海洋大學(xué)，2012.

[2] 周 丹.雌核發(fā)育雙單倍體牙鲆(Paralichthys olivaceus)的純合性鑒定和性腺的組織學(xué)觀察[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 方永強(qiáng)，Welsch U.文昌魚卵巢中濾泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及功能的研究[J].中國(guó)科學(xué)(B輯)，1995，25(10)：1079-1085，1121-1122.

[4] 劉少軍.革胡子鲇原始生殖細(xì)胞的起源、遷移及性腺分化[J].水生生物學(xué)報(bào)，1991，15(1)：1-7，97-99.

[5] 施瑔芳，尹伊偉，胡傳林.鰱魚性腺周年變化的研究[J].水生生物學(xué)集刊，1964，5(1)：77-94.

[6] 劉 筠.中國(guó)養(yǎng)殖魚類繁殖生理學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993.

[7] 張耀光，羅泉笙，何學(xué)福.長(zhǎng)吻鮠的卵巢發(fā)育和周年變化及繁殖習(xí)性研究[J].動(dòng)物學(xué)研究，1994，15(2)：42-48，98.

[8] Streisinger G，Walker C，Dower N，et al.Production of clones of homozygous diploid zebra fish(Brachydanio rerio)[J].Nature，1981，291(5813)：293-296.

[9] Müller-Belecke Andreas，H?rstgen-schwark Gabriele.Sex determination in tilapia(Oreochromis niloticus)sex ratios in homozygous gynogenetic progeny and their offspring[J].Aquaculture，1995，137(1-4)：57-65.

[10] Maack G，Segner H.Morphological development of the gonadsin zebrafish[J].Journal of Fish Biology，2003，62(4)：895-906.

[11] Carrasco LA，Penman D J，Bromage N.Evidence for the presence of sex chromosomes in the Nile tilapia(Oreochromis niloticus)from synaptonemal complex analysis of XX，XY and YY genotypes[J].Aquaculture，1999，173(1-4)：207-218.

[12] Devlin Robert H，Nagahama Yoshitaka.Sex determination and sex differentiation in fish：An overview of genetic，physiological，and environmental influences[J].Aquaculture，2002，208(3-4)：191-364.

[13] Sarder M R，Penman D J，M yers JM，et al.Production and propagation of fully inbred clonal lines in the Nile tilapia(Oreochromis niloticusL.)[J].Journal of Experimental Zoology，1999，284(6)：675-685.

[14] Karayücel ?sm ihan，Ezaz Tariq，Karayücel Sedat，et al.Evidence for two unlinked“sex reversal”loci in the Nile tilapia，Oreochromis niloticus，and for linkage of one of these to the red body colourgene[J].Aquaculture，2004，234(1-4)：51-63.

[15] Yamamoto Eiichi.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in hirame，Paralichthys olivaceus(Temm inck etSchlegel)[J].Aquaculture，1999，173(1-4)：235-46.

[16] Tabata K.Induction of gynogenetic diploidmales and presumption of sex determination mechanisms in the hirameParalichthys olivaceus[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries，1991，57：845-850.

[17] 孫 鵬，尤 鋒，張立敬，等.牙鲆性腺分化的組織學(xué)研究[J].海洋科學(xué)，2009，33(3)：53-58.

[18] 孫朝徽.牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺分化與發(fā)育的組織學(xué)研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.