油桐烯脂酰CoA還原酶的克隆與表達模式分析

劉美蘭，譚曉風，龍洪旭

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

油桐烯脂酰CoA還原酶的克隆與表達模式分析

劉美蘭，譚曉風，龍洪旭

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

以葡萄桐近成熟種子為材料，根據(jù)油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已知部分烯脂酰CoA還原酶(enoyl-CoA reductase,ECR)序列，利用RACE克隆技術(shù)，克隆得油桐烯脂酰CoA還原酶的全長cDNA序列，命名為VfECR，并對該基因的核苷酸序列及其相應(yīng)氨基酸序列的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系進行分析。結(jié)果表明：該基因全長1 154 bp，含有一個933 bp的開放閱讀框，編碼310個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白，含有6個明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，且與陸地棉ECR蛋白的同源性最高，親緣關(guān)系最為接近。同時利用RT-qPCR對VfECR基因的組織特異性和種子發(fā)育過程中的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)油桐VfECR基因主要在種仁中表達，在根、莖、葉等組織中表達量較少；在種子發(fā)育過程中，近成熟（8月、9月）到成熟種子（10月）中的表達量要明顯高于未成熟種子（6月、7月）。

生物信息學(xué)；油桐；超長鏈脂肪酸；烯脂酰CoA還原酶；克隆技術(shù)；表達模式

超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)是生物體內(nèi)脂肪酸碳原子數(shù)超過18 C 的脂類，該類脂肪酸在生物體中具有廣泛的生理功能，它們與種子甘油酯、鞘脂及生物膜膜脂的合成有關(guān)，更為重要的是它們?yōu)榻琴|(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成提供前體物質(zhì)[1]。同時，VLCFAs 還可以通過調(diào)控極性生長素載體PIN1的定位而影響極性生長素的運輸，進而影響植物根的橫向形成及胚胎發(fā)育[2]。VLCFAs的生物合成主要可分為3個步驟：飽和脂肪酸的從頭合成、脂肪酸碳鏈的延長和不飽和鍵的形成。脂肪酸碳鏈的延伸主要發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以脂酰CoA作為起點，通過縮合、還原、脫水、再還原4個步驟循環(huán)完成碳鏈的延伸進而合成VLCFAs[3]。參與脂肪酰-CoA延長的酶屬于膜綁定多酶復(fù)合體，包括β- 酮脂酰-CoA合酶(β-ketoacyl-CoA synthase, KCS)、β- 酮 脂 酰 -CoA還原酶 (β-ketoacyl-CoA re-ductase, KCR)、β- 羥脂酰 -CoA 脫 水 酶 (β-hydroxacyl- CoA dehydratase，HCD) 和反式烯脂酰-CoA還原酶(trans-2, 3-enoyl-CoA reductase,ECR)，是影響超長鏈脂肪酸合成的主要酶類體[4]。

ECR是超長鏈脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，它催化最后一步還原反應(yīng)，將反式烯脂酰-CoA 催化成?；?CoA[5]。Kohlwein等[6]首次從一個溫度敏感且鞘脂合成缺陷型的酵母突變體tsc13 中分離出編碼ECR的基因TSC13，研究表明該基因編碼的蛋白與酵母中編碼KCS的基因Elo2p和Elo3p相互作用催化合成VLCFAs。目前的研究表明，鞘脂參與細胞的生長、分化、衰老、凋亡以及應(yīng)急反應(yīng)等都有著非常密切關(guān)系。在酵母中，催化VLCFAs合成的延長酶基因發(fā)生突變，積累的鞘脂將大幅度減少，進而使酵母的生長受到抑制[5-7]。擬南芥At3g55360(AtTSC13) 功能互補于酵母突變體tsc13實驗發(fā)現(xiàn)可在擬南芥植株中普遍表達[8]。在擬南芥cer10突變體中，將T-DNA 插入At3g55360基因內(nèi)，植株中鞘脂、角質(zhì)層蠟與種子的VLCFAs 合成受到阻礙，抑制了細胞擴增，從而導(dǎo)致植株形態(tài)改變[9]。抑制煙草中的ECR基因功能，會影響膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉表皮細胞受損[10]。Song等[11]也通過定量 RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)棉花的GhECR在纖維延長的過程中表達量提高。根據(jù)上述研究表ECR基因產(chǎn)物參與VLCFAs的合成，影響由VLCFAs 參與合成的鞘脂、角質(zhì)層蠟與種子甘油酯的積累，從而影響植物的正常生長。

油桐Vernicia fordii為落葉喬木，在我國已有上千年栽培歷史，與油茶、核桃、烏桕并稱為我國四大木本油料樹種之一[12-13]。桐油是重要工業(yè)用油，不僅是制造優(yōu)質(zhì)油漆和油墨的基本原料，還是制造生物柴油和優(yōu)質(zhì)復(fù)合功能新材料的原料，具有非常高的經(jīng)濟利用價值[14]。隨著能源缺乏和桐油加工綜合利用技術(shù)的提高，發(fā)展油桐產(chǎn)業(yè)已迫在眉睫，油桐的種質(zhì)資源保護、良種選育以及高產(chǎn)栽培技術(shù)受到了關(guān)注[15-16]。ECR是超長鏈脂肪酸合成酶之一，它通過影響VLCFAs的合成進而影響植物的正常生長以及種子甘油酯的積累。目前，由于對油桐相關(guān)的分子研究比較少，有關(guān)油桐超長鏈脂肪酸合成代謝相關(guān)基因的研究只有KCS被克隆出來[17]，其它基因的研究尚未見有報導(dǎo)。該研究在本實驗室油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，首次克隆獲得了ECR基因，并對該基因進行了序列特征和生物信息學(xué)分析；同時還對該基因的組織特異性和種子不同發(fā)育時期的表達模式進行了分析，為今后進一步深入開展揭示油桐超長鏈脂肪酸合成代謝與油桐生長發(fā)育等生理過程的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為油桐分子改良育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)油桐試驗基地（國家油桐種質(zhì)資源保存庫）油桐品種‘葡萄桐’的不同組織（根、莖、葉、葉柄、種仁、種皮、種柄、雄蕊、萼片、柱頭、花瓣、子房）和不同發(fā)育時期種子（6月到10月）為實驗材料，-80℃的超低溫冰箱貯存。實驗的主要試劑有：購自全式金公司的大腸桿菌Trans-T1、2×EasyTaq PCR SuperMix、pEASYBlunt Simple Cloning Kit；購自Invitrogen公司的PureLinkTM RNA Mini Kit、3'RACE 試劑盒、5'RACE 試劑盒；購自Takara公司的PrimeSTAR HS DNA Polymerase、2×SYBR Green qPCR Mix、PrimeScript? TR reagent Kit；購自 Fermentas公司RrevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit ；購自安比奧生物技術(shù)有限公司的Gel Extraction Kit；由華大基因完成引物合成，博尚公司完成測序結(jié)果，其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 油桐總RNA的提取與單鏈cDNA的合成

以油桐品種‘葡萄桐’8月份近成熟種子為試材，采用CTAB裂解法+試劑盒的方法[18]提取RNA，并用瓊脂糖凝膠電脈檢測RNA的完整性。利用普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒和3′RACE、5′RACE試劑盒合成單鏈cDNA，具體方法見說明書。

1.2.2 油桐ECR的PCR擴增

根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫ECR基因的部分片段704 bp，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計RACE擴增的引物，分別為5GSP:5'CCCATCACAGTAGTCATTAAGACTCT 3'和3GSP:5' GTGGAGGGTATCAAATCCCACGTG 3'，以RACE試劑盒反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板進行PCR擴增并測序，具體反應(yīng)體系和程序見試劑盒說明書。將已有序列和RACE擴增得到序列進行拼接，設(shè)計ECR全長擴增引物，為F:5' CTTCTTGATGAATCTTTGAGCAC 3'和R:5'CGTAACCACAATCTGGAACTCAT 3'，以普通反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板進行PCR擴增并測序。

1.2.3 生物學(xué)信息分析

根據(jù)ECR的全長序列，用GeneDoc和Vector NTI軟件查找出開放閱讀框，并推出其編碼的氨基酸序列；利用在線NCBI blastp對該基因進行比對分析及下載同源序，并用GeneDoc 軟件進行多序列比對，用MEGA5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線ProtParam、ProtScale、TMpred等軟件對其進行理化性質(zhì)、親/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域分析；采用在線工具SOPMA 和SWISS-MODE分別進行二維結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，并利用本地軟件UCSF Chimera對三維結(jié)構(gòu)進行分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR

以油桐品種‘葡萄桐’12個組織（根、莖、葉、葉柄、雄蕊、萼片、柱頭、花瓣、子房、種仁、種皮和種柄）和9個時期（6月1日、6月15日、7月1日、7月15日、8月1日、8月15日、9月1日、9月15日和10月1日）種子為材料，總RNA的提取采用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒和CTAB裂解法抽提[17]，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用紫外可見光分光光度計檢測核酸的純度。單鏈cDNA的合成按照Takara公司的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成，具體方法見說明書。以油桐的持家基因EF1α[19]為內(nèi)參，清水模板為陰性對照，ECR基因的定量引物為E-F:5' ACGCAGTGGTAGAGAGC 3'和E-R: 5' GGAAGAGGAAGGGTCAG 3'（引物經(jīng)檢測驗證），RT-qPCR的具體反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見Takara公司的2×SYBR Green qPCR Mix說明書，每個反應(yīng)重復(fù)3次。本實驗使用BIO-RAD公司的定量PCR儀，采用96孔板完成PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油桐ECR基因全長cDNA的克隆

將油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到的704 bp片段進行NCBI在線blast，初步確定此序列為油桐ECR基因的部分序列。為了更好的確定該基因，本研究通過5′RACE擴增技術(shù)獲得此序列5′端的365 bp，3′RACE擴增獲得3’端的459 bp（見圖1），用Vector NTI軟件將已知序列與5’RACE和3’RACE序進行拼接，得到一條長為1 308 bp的cDNA。為了一步確定拼接序列的正確性，在該序列5’端和3’端再次設(shè)計引物進行PCR擴增并測序驗證，測序結(jié)果獲得一條長為1 154 bp的cDNA序列，經(jīng)比對分析與拼接序完全一致。將獲得的1 154 bp片段進行在線同源搜所發(fā)現(xiàn)，該序列與不同的物種的ECR基因序列有較高的相似性，因此可初步推測此序列為油桐ECR基因的cDNA。

2.2 油桐ECR基因全長cDNA 及氨基酸的序列特征分析

利用在線NCBI ORF Finder和GeneDoc軟件分析獲得的cDNA序列發(fā)現(xiàn)，此序列存在一個編碼310個氨基酸的開放閱讀框，全長為933 bp（170～1 103），起始密碼是ATG，終止密碼是TAG（見圖2紅色部分）。將推導(dǎo)出的油桐ECR基因氨基酸序列與GenBank中已注冊的其它植物ECR基因的氨基酸序列進行比對分析，從表1可看出油桐ECR基因與其它16種植物的ECR基因都有較高的相似性，相似度都在80%以上，且與陸地棉的相似性最高為90%，由此可判斷本研究獲得的序列確實為油桐ECR基因，命名為VfECR。

圖1 油桐ECR基因全長cDNA的PCR擴增Fig.1 PCR amplif i cation results of ECR gene’s full length cDNA in V. fordii

圖2 油桐ECR基因全長cDNA序列及氨基酸序列Fig.2 Full length cDNA and amino acid sequence of VfECR in V. fordii

表1 ECR基因的氨基酸序列比較Table 1 Alignment of ECR amino acid sequence

2.3 油桐ECR與不同物種ECR的同源性比對和親緣關(guān)系分析

在NCBI中下載不同物種ECR基因的蛋白質(zhì)序，利用本地軟件GeneDoc進行同源比對發(fā)現(xiàn)，油桐ECR與不同物種ECR的蛋白質(zhì)序列之間有較高的同源性，整個蛋白質(zhì)序僅在第50～80 aa之間特異性較強，而靠近N端和C端的序列保守性最高（見圖3黑色區(qū)域）。利用MEGA5.1中的Neighbor-joining法對各物種間的親緣關(guān)系進行分析表明，油桐ECR與陸地棉的親緣關(guān)系最為接近，它們同屬于同一樹枝，且遺傳距離也相同，如圖4所示，圖中數(shù)字為遺傳距離。

2.4 油桐ECR蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測與分析

圖3 油桐ECR與不同物種ECR蛋白的同源序列比對Fig.3 Homologous sequence alignments between of V. fordiiECR and different species

圖4 油桐ECR與不同物種ECR蛋白的聚類分析Fig.4 Cluster analyses of V. fordiiECR and different species

油桐ECR基因CDS長為933 bp，編碼310個氨基酸，由20種氨基酸組成，如圖5所示，其中最多的是亮氨酸（Leu）占11%，其次是苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），分別都占8.1%，最少的是甲硫氨酸（Met）僅占1.6%。該蛋白的相對分子量為36.21 kDa，原子組成為C1704H2543N427O426S12，理論等電點9.55，不穩(wěn)定系數(shù)為47.71，總平均疏水指數(shù)是-0.015，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖5 油桐ECR蛋白的氨基酸組成Fig.5 Amino acid composition of V. fordiiECR protein

2.5 油桐ECR蛋白親水性/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析

根據(jù)在線軟件ProtScale的分析結(jié)果表明，油桐ECR蛋白氨基酸殘基中以A270疏水性最強（3.411），以A289親水性最強（-2.867），且整個蛋白質(zhì)序列中親水性氨基酸殘基數(shù)明顯多于疏水性氨基酸殘基（見圖6A），因此油桐ECR蛋白是親水性蛋白，與上述的預(yù)測結(jié)果相一致。通過在線TMpred和TMHMM工具預(yù)測油桐ECR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在6個跨膜結(jié)構(gòu)域（見圖6B），最可能分布的位置分別是A94～A116、A126～ A143、A164～ A183、A198～ A220、A233～A255、A259～A281，N 端在細胞膜內(nèi)的可能性為0.964 58。

圖6 油桐ECR蛋白親水性/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.6 Predicted hydrophilicity prof i le and transmembrane domains of V. fordiiECR

2.6 油桐ECR蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

由圖7可知，油桐ECR蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α- 螺旋和無規(guī)則卷曲2種主要結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成，它們分別占整個序列的33.87%和37.42%，其次是延伸鏈占24.19%，最少的是β- 轉(zhuǎn)角僅占4.52%。利用在線SWISS-MODE預(yù)測軟件的auto mode 建模方式，以1c3t.1.A蛋白為模板對油桐ECR蛋白進行同源建模，圖8為油桐ECR蛋白的三維空間模型。

2.7 油桐ECR基因的組織表達特異性和種子表達模式分析

2.7.1 油桐ECR基因的組織表達特異性分析

圖7 油桐ECR蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Predicted secondary structure of V. fordiiECR protien

圖8 油桐ECR蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測Fig.8 Predicted tertiary structure of V. fordiiECR protien

根據(jù)RT-qPCR檢測油桐ECR基因在12個組織（根、莖、葉、葉柄、雄蕊、萼片、柱頭、花瓣、子房、種仁、種皮和種柄）的表達量發(fā)現(xiàn)，該基因在種仁中的表達量是最高的，且是根表達量的20多倍，其次是在花的5個組織（雄蕊、子房、萼片、柱頭和花瓣），而在根、莖、葉、葉柄、種皮和種柄的表達量則非常少（見圖9A）。

2.7.2 油桐ECR基因在種子中的表達模式分析

利用RT-qPCR對9個不同發(fā)育時期（6月1日、6月15日、7月1日、7月15日、8月1日、8月15日、9月1日、9月15日、10月1日）油桐種仁內(nèi)ECR基因的表達量進行檢測表明，從6月份到8月份，油桐種仁內(nèi)ECR基因的表達量是隨著種子的不斷成熟而不斷增加的，在9月份到10月份之間，ECR基因的表達量稍有減少，但總的表達量比6月份和7月份的要高很多。

3 結(jié)論與討論

烯脂酰輔酶CoA 還原酶是超長鏈脂肪酸合成代謝中最后一個還原性酶，它將β-烯酯酰-CoA 還原生成延長了2個碳鏈的酯酰-CoA(20:1-CoA)，它可以再次進入延長酶復(fù)合體中，生成更長鏈的脂肪酸，或被釋放出來[20]。因此，生物體內(nèi)超長鏈脂肪酸能否最終合成將由烯脂酰輔酶CoA還原酶決定。超長鏈肪酸不僅在生物體內(nèi)具有重要的生理生化功能，還具有重要的工業(yè)用途。本研究在已構(gòu)建的油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上[21]，通過RACE 技術(shù)獲得了油桐ECR基因的全長cDNA。該基因全長1 154 bp，含有1個933 bp的編碼框，編碼1個含有310個氨基酸的蛋白質(zhì)。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，油桐ECR基因與其它物種的ECR基因都有較高的相似性，相似度都在80%以上，且與陸地棉的相似度達90%；同時從油桐ECR蛋白與不同物種ECR蛋白的同源比對分析和系統(tǒng)進化樹來看，不同物種的ECR蛋白序列之間同源性相當高，且有多個高度保守區(qū)域，不同物種之間系統(tǒng)進化樹上的遺傳距離相對較小，油桐ECR蛋白與陸地棉屬于同一進化樹枝，遺傳距離相同。這表明油桐ECR與其它物種的ECR在進化上差異較小，保守性強。根據(jù)生物信息學(xué)分析表明，VfECR蛋白的分子量為36.21 kDa，等電點9.55，是一個含有6個比較明顯跨膜結(jié)構(gòu)域且不穩(wěn)定的親水性蛋白，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中是以α- 螺旋和無規(guī)則卷曲2種主要結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成為主，有少量的延伸鏈和β- 轉(zhuǎn)角。

圖9 油桐ECR基因的表達分析Fig.9 Expression analysis of V. fordiiECR

1997年Millar等[22]研究表明ECR基因為所有微粒體脂肪酸延長酶復(fù)合體所共有，呈泛組織表達，不具有底物特異性。2005年Qin等[23]通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)棉花中的2個ECR基因都棉花纖維的延伸過程中優(yōu)先表達，但在根、莖、葉中表達量較低。為了探討油桐中ECR基因的組織特異表達情況，本研究利用RT-qPCR檢測了油桐的12個組織(根、莖、葉、葉柄、雄蕊、萼片、柱頭、花瓣、子房、種仁、種皮和種柄）中ECR的表達量，結(jié)果表明VfECR主要在種仁中表達，其表達量是根的20多倍，而在根、莖、葉、葉柄、種皮和種柄的表達量較低，這可能與油桐種仁中含油量相當高有關(guān)，大量的VLCFAs參與種子甘油酯的積累。進而本研究還對不同發(fā)育時期種子內(nèi)VfECR基因的表達模式進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在油桐種子近成熟（8月）至成熟（10月）時期都有較高的表達。由此可推測VfECR基因在油桐超長鏈脂肪酸合成代謝中發(fā)揮著重要作用。

油桐作為世界上著名的木本工業(yè)油料樹種，研究油桐超長鏈脂肪酸合成代謝的分子機理有助于對油桐進行定向的遺傳改良及油桐生長發(fā)育相關(guān)生理代謝的探究，同時對其他油料作物的基礎(chǔ)研究也有一定的參考價值。本研究對超長鏈脂肪酸合成相關(guān)的重要酶ECR進行了初步分析，并探討分析了其在不同組織和不同發(fā)育過程中種子的表達量變化規(guī)律，這為今后對其蛋白進行活性分析，和進一步的研究其轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育相關(guān)重要的生理功能奠定了重要基礎(chǔ)，進而為指導(dǎo)油桐遺傳改良奠定重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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Cloning and expression of enoyl-CoA reductase in Vernicia fordii

LIU Mei-lan, TAN Xiao-feng, LONG Hong-xu
(Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, China Ministry of Education, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

By taking PUPUTUNG tree seeds as the tested materials, according to the known part’s (enoyl-CoA reductase,ECR) sequence and by using RACE technology, PUPUTUNG tree seed’sECRgene was cloned and the gene’s full-length cDNA was obtained, namedVfECR. The physicochemical property, hydrophobicity or hydrophilicity, transmembrane structure, secondary and tertiary structure of protein, phylogenetic evolution and so on of the gene’s nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence were analyzed.The results show that full-length cDNA ofVfECRgene was 1 154 bp, and the CDS length 933 bp, encoded 310 aa; It is a hydrophilic protein which had 6 obvious transmembrane structures, this protein had the highest similarity and closest relationship withGossypium hirsutum; By the analysis of RT-qPCR in tung-oil tree different tissues and theirs development,VfECRgene mainly expressed in seed kernel, and there were little expression in root, stem, leaf and other tissues; During the development of seeds, the expression of close-tomaturity (August, September) and maturity (October) seeds were obviously higher than immature stage (June, July) seeds.

bioinformatic;Vernicia fordii; VLCFAs; enoyl-CoA reductase; cloning technology; expression pattern

S794.3；S603.2

A

1673-923X(2014)11-0009-09

2014-01-12

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項重點項目（201204403）

劉美蘭（1988-），女，廣東韶關(guān)人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟林栽培育種研究；E-mail：1015626140@qq.com

譚曉風（1956-），男，湖南茶陵人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟林栽培育種和林業(yè)生物技術(shù)研究；

E-mail：tanxiaofengcn@126.com

[本文編校：吳 毅]