銅胺氧化酶基因PpCuAO4在桃成熟中的功能鑒定

王 偉 程 鑫 崔振國(guó) 蔣亞博 譚 彬 程 鈞 張郎郎 馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/河南省果樹(shù)瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

桃(PrunuspersicaL.)果實(shí)味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種深受人們喜愛(ài)的大眾水果。然而，桃作為一種典型的呼吸躍變型果實(shí)，成熟后不耐貯藏，嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。乙烯是調(diào)控桃果實(shí)成熟衰老的關(guān)鍵植物激素[1]。研究表明，多胺(polyamine)作為一種乙烯作用拮抗劑，能夠延緩桃果實(shí)成熟衰老，是一種具有潛力的天然果實(shí)貯藏保鮮劑[2]。

多胺是一種小分子脂肪族含氮堿，廣泛存在于自然界各種有機(jī)生物體內(nèi)，包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌和真菌等[3]。多胺在植物發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，能夠參與花的分化和發(fā)育、葉片發(fā)育和衰老、果實(shí)發(fā)育和成熟、非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答等眾多生理生化過(guò)程[3]。植物體內(nèi)最常見(jiàn)的3種多胺分別是腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)[4]。植物多胺的合成起始于Put的合成。植物中Put生物合成主要由精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)催化完成[5]。Put合成后作為前體物質(zhì)在Spd合成酶(spermidine synthase，SPDS)和硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)的催化下生成Spd。Spd則進(jìn)一步在Spm合成酶(spermine synthase，SPMS)和SAMDC的催化下生成Spm[6]。此外，多胺合成代謝路徑與一些其他重要物質(zhì)代謝路徑相互聯(lián)系，構(gòu)成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)。例如，多胺合成與乙烯合成具有相同的前體物質(zhì)腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmeth-onine)，目前已有許多研究表明增加其中任意一種物質(zhì)的合成都會(huì)影響另外一種物質(zhì)的合成，但這一觀點(diǎn)還存在爭(zhēng)議[7]。植物體內(nèi)多胺的氧化分解主要由銅胺氧化酶(copper amine oxidase, CuAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase, PAO)參與完成。CuAO主要催化Put的氧化反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生氨(NH4+)、4-氨基丁醛(4-aminobutyrate)及過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)等分解產(chǎn)物；4-氨基丁醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，CuAO同樣參與Spd的分解代謝[9]。PAO主要參與催化Spd、Spm及其乙酰化衍生物的分解代謝。根據(jù)功能可將PAO分為兩類：第一類參與多胺末端分解反應(yīng)，分解Spd和Spm并產(chǎn)生二氨基丙烷(diaminopropane，Dap)和H2O2等分解產(chǎn)物[4]；第二類參與回復(fù)反應(yīng)，即催化Spm到Spd以及Spd到Put的反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生H2O2等產(chǎn)物[10]。

有研究報(bào)道，在桃果實(shí)發(fā)育早期和成熟前，采用多胺處理均可延緩桃果實(shí)成熟[11-12]。汪開(kāi)拓等[2]研究發(fā)現(xiàn)，采用Spd處理采收后的白鳳水蜜桃可以顯著降低桃果實(shí)貯藏期間腐爛率，并且可以促進(jìn)多胺合成基因PpSAMDC、PpSPDS、PpADC等上調(diào)表達(dá)，同時(shí)抑制乙烯合成關(guān)鍵基因PpACS1、PpACO1表達(dá)水平，減少乙烯合成，延緩桃果實(shí)成熟衰老。此外，劉新婷等[13]發(fā)現(xiàn)Spd處理可有效延緩番木瓜果實(shí)軟化，顯著降低果實(shí)呼吸速率并延緩果實(shí)色澤的轉(zhuǎn)變。除了外源多胺處理，研究發(fā)現(xiàn)利用基因工程在番茄中超量表達(dá)桃PpADC基因能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)ut積累，抑制赤霉素合成，最終導(dǎo)致植株生長(zhǎng)矮化，開(kāi)花和結(jié)果延遲[14]。另一方面，通過(guò)抑制內(nèi)源多胺分解，同樣可以延緩果實(shí)成熟。有研究發(fā)現(xiàn)采用PAO抑制劑處理可以顯著延緩葡萄和桃果實(shí)成熟[11,15-16]。

在果實(shí)發(fā)育前期，多胺含量一般較高，隨著果實(shí)的發(fā)育和成熟，多胺含量逐漸降低，并且該現(xiàn)象在呼吸躍變型和呼吸非躍變型果實(shí)中普遍存在[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，在富士蘋果花后30～80 d，Put和Spm含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[18]。番茄中的研究發(fā)現(xiàn)在果實(shí)快速發(fā)育階段多胺合成基因SPMS和分解基因CuAO表達(dá)水平均顯著升高，并且CuAO基因從破色期到成熟期均維持高表達(dá)水平，而SPDS1基因表達(dá)量在果實(shí)完熟期達(dá)到高峰[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與SlSPMS、SlADC和SlODC在成熟期的較低表達(dá)水平相比，SlSPDS2在番茄果實(shí)成熟中可能發(fā)揮主要作用[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)，黃水蜜桃中Put、Spd和Spm含量均隨著果實(shí)成熟逐漸降低，與此同時(shí)多胺合成關(guān)鍵基因PpADC、PpSPDS和多胺氧化酶基因PpPAO1表達(dá)水平均顯著升高，PpPAO1介導(dǎo)的Spd和Spm的氧化分解直接導(dǎo)致多胺積累降低[11]。研究報(bào)道多胺分解產(chǎn)生的H2O2是一種信號(hào)分子，能夠誘導(dǎo)果實(shí)成熟和逆境應(yīng)答[21]。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)桃生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)桃中有4個(gè)CuAO基因，分別是PpCuAO1～PpCuAO4，其中PpCuAO4介導(dǎo)的Put分解是導(dǎo)致桃果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中多胺積累降低的重要原因[22]。然而，CuAO介導(dǎo)的多胺分解在桃果實(shí)成熟中的作用，尤其是PpCuAO4在桃果實(shí)成熟中的功能仍然不清楚。基于此，本研究采用CuAO抑制劑處理驗(yàn)證CuAO介導(dǎo)的多胺分解在桃果實(shí)成熟過(guò)程中的作用，同時(shí)利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(virus induced gene silence，VIGS)分析PpCuAO4在桃果實(shí)成熟中的功能，旨在為進(jìn)一步深入研究多胺調(diào)控桃果實(shí)成熟的機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料選擇種植在鄭州市惠濟(jì)區(qū)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)的7年生黃水蜜桃，采用獨(dú)立主干樹(shù)形，株行距為1.5 m×3.5 m，常規(guī)田間管理。黃水蜜桃為軟溶質(zhì)桃，成熟期在7月初，成熟后迅速出現(xiàn)呼吸高峰和乙烯釋放高峰，果肉迅速軟化。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CuAO抑制劑處理 選取樹(shù)齡大小一致和果實(shí)負(fù)載量適中的黃水蜜桃樹(shù)，每株樹(shù)從東、南、西、北4個(gè)方向隨機(jī)選擇4個(gè)枝條，選取生長(zhǎng)狀態(tài)及成熟度一致(均處于果實(shí)第二次膨大期)的桃果實(shí)各100個(gè)，在花后90 d分別用含0.1% Tween 20的1.0、5.0和10.0 mmol·L-1CuAO抑制劑氨基胍(aminoguanidine，AG)對(duì)桃果實(shí)進(jìn)行噴施處理，每7 d噴施1次，連續(xù)噴施2次，同時(shí)采用含 0.1% Tween 20的清水處理作為對(duì)照。在桃果實(shí)成熟后采摘處理果實(shí)，于25℃黑暗條件貯藏，于采收后第0、第3 和第7天測(cè)定果實(shí)硬度。

1.2.2 VIGS沉默桃果實(shí)PpCuAO4基因 利用PCR擴(kuò)增PpCuAO4基因cDNA非保守區(qū)序列，片段大小為325 bp，引物序列見(jiàn)表1。利用同源重組方法將所擴(kuò)增片段插入到pTRV2載體中，構(gòu)建完成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株。VIGS誘導(dǎo)桃果實(shí)基因沉默方法參考文獻(xiàn)[23]，具體方法如下：分別將含有重組質(zhì)粒和pTRV2空載質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液，以及含有pTRV1載體的GV3101菌液按體積比1∶1等量混合后，選取花后90 d的黃水蜜桃果實(shí)進(jìn)行接種，利用注射法接種到果實(shí)靠近果柄的果肉中，每個(gè)果實(shí)均選取2處注射，每個(gè)混合菌液各注射50個(gè)發(fā)育狀態(tài)一致的果實(shí)，注射10 d后采樣。設(shè)置3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

表1 基因克隆及定量分析所用引物序列Table 1 Primers used for gene cloning and qRT-PCR

1.2.3 基因表達(dá)分析 以注射針孔所在位置為中心，用手術(shù)刀切取半徑約1 cm的侵染區(qū)域果實(shí)，用于檢測(cè)PpCuAO4沉默效率。采用已接種pTRV1、pTRV2和未接種的果實(shí)為對(duì)照。桃果實(shí)總RNA提取參見(jiàn)上海生工柱式植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant total RNA Purification Kit)說(shuō)明?？俁NA濃度及純度采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific, 美國(guó))檢測(cè)，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性。cDNA合成采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit，日本)。反轉(zhuǎn)錄的cDNA于-80℃保存?zhèn)溆?。利用?shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)PpCuO4及果實(shí)成熟相關(guān)基因PpACO1、PpACS、PpPIN1、PpGH3.3、PpPG和PpPMEI的表達(dá)。所用定量引物序列見(jiàn)表1，以PpEF2作為內(nèi)參基因?；虮磉_(dá)分析采用ABI 7500Fast系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))，運(yùn)行程序采用95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，95℃退火3 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物于12℃條件下保存?；虮磉_(dá)量分析采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4 桃果實(shí)多胺測(cè)定 采用乙腈浸提法提取多胺，具體方法如下：取2 g桃果肉于液氮中研磨至粉末，稱取0.5 g粉末，加入2 mL 20%乙腈，于冰水浴中超聲提取30 min；隨后于4℃、10 000×g條件下離心3 min，取上清液，沉淀加入2 mL 20%乙腈再浸提1次；加入乙腈定容至5 mL；4℃、10 000×g條件下離心3 min，取上清液1 mL，采用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，使用po-roshell 120 SB-C18反相色譜柱(Agilent，美國(guó))上機(jī)檢測(cè)。利用液相質(zhì)譜(liquid chromatography-electrospray mass spectrometry，HPLC-MS)檢測(cè)，流動(dòng)相A為90%乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸，流速設(shè)定為0.3 mL·min-1， 梯度洗脫。自由態(tài)多胺含量檢測(cè)采用安捷倫1260串聯(lián)6420A高效液相質(zhì)譜(Agilent，美國(guó))聯(lián)用法，由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.5 桃果實(shí)成熟相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定 果實(shí)硬度測(cè)定：采用GY-4型壓力測(cè)試儀(托普儀器，杭州)測(cè)定。

呼吸強(qiáng)度測(cè)定：將待測(cè)桃果實(shí)放入裝有橡皮塞的密封盒子，于室溫條件下密閉1 h后采用OXYBABY 6.0 O2/CO2頂空分析儀(WITT，德國(guó))測(cè)定。

乙烯釋放速率測(cè)定：將桃果實(shí)放入氣密性良好的密封盒子中測(cè)量乙烯產(chǎn)量，并在室溫條件下放置1 h，然后取1 000 μL氣體樣品并注入填充GC 2010 Plus氣相色譜儀(Shimadzu, 日本)分析；檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器，色譜柱為GDX-502型填充色譜柱；進(jìn)樣口溫度110℃，色譜柱溫度60℃，檢測(cè)器溫度150℃；載氣為氮?dú)?，載氣流速為40 mL·min-1。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 17.0進(jìn)行處理及差異顯著性分析，差異顯著性分析檢驗(yàn)方法為t檢驗(yàn)，P<0.05。所用誤差均為標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation, SD)?；虮磉_(dá)分析和果實(shí)生理指標(biāo)測(cè)定均不少于3次生物學(xué)重復(fù)。使用SigmaPlot 12.5進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AG處理延緩桃果實(shí)成熟

為了探究CuAO介導(dǎo)的多胺氧化分解在桃果實(shí)成熟中的功能，分別采用1、5和10 mmol·L-13種不同濃度的AG處理黃水蜜桃果實(shí)。結(jié)果顯示，采用5和10 mmol·L-1AG處理果實(shí)的硬度在采后第3和第7天不同程度地顯著高于對(duì)照水平，并且5 mmol·L-1AG處理的效果更顯著(P<0.001)，而1 mmol·L-1AG處理的桃果實(shí)硬度與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異(圖1)。說(shuō)明AG處理可延緩黃水蜜桃果實(shí)軟化，且 5 mmol·L-1AG處理效果最好，因此后續(xù)試驗(yàn)采用5 mmol·L-1AG處理。

注：*、**、***分別表示與對(duì)照相比在0.05、0.01、0.001水平上差異顯著。下同。Note: *, **, *** indicate significant differences between the AG treatment and control fruits a 0.05, 0.01, 0.001 level, respectively. The same as following.圖1 不同濃度AG處理黃水蜜桃果實(shí)硬度測(cè)定Fig.1 The fruit firmness of Huangshuimi peach under the treatment of different concentrations of AG

由圖2-A可知，與對(duì)照相比，5 mmol·L-1AG處理后黃水蜜桃果實(shí)著色明顯延緩。同時(shí)發(fā)現(xiàn)桃果實(shí)硬度在采后7 d內(nèi)呈明顯下降趨勢(shì)，但AG處理下桃果實(shí)硬度在處理第2、第3和第5天仍顯著高于對(duì)照水平(圖2-B)。乙烯釋放量測(cè)定顯示，桃果實(shí)采后乙烯釋放量迅速上升，并在第3天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，AG處理下果實(shí)乙烯釋放量在前4 d及第7天依然顯著低于對(duì)照組(圖2-C)。果實(shí)呼吸強(qiáng)度結(jié)果顯示，對(duì)照組果實(shí)呼吸強(qiáng)度在處理第2天略有上升，隨后逐漸下降，而AG處理組桃果實(shí)呼吸強(qiáng)度整體呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，并且在處理第2至第4天顯著低于對(duì)照水平(圖2-D)。綜上所述，5 mmol·L-1AG處理可顯著延緩桃果實(shí)軟化速度，降低乙烯釋放量和呼吸速率，從而延緩桃果實(shí)成熟。

圖2 5 mmol·L-1AG處理黃水蜜桃果實(shí)表型及成熟相關(guān)生理數(shù)據(jù)Fig.2 The phenotype and fruit quality traits of Huangshuimi peach under the treatment of 5 mmol·L-1 AG

2.2 AG處理抑制桃果實(shí)成熟相關(guān)基因表達(dá)

為了進(jìn)一步解析CuAO抑制劑處理延緩桃果實(shí)成熟軟化的分子機(jī)理，采用qRT-PCR技術(shù)分析AG處理后桃果實(shí)乙烯合成、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞壁降解相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，AG處理后桃乙烯合成關(guān)鍵基因PpACO1和PpACS的相對(duì)表達(dá)水平在采后第3和第5天均顯著低于對(duì)照(圖3-A、B)。同時(shí)，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)相關(guān)基因PpPIN1、PpGH3.3以及細(xì)胞壁降解相關(guān)基因PpPG、PpPMEI的相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照(圖3-C～F)。上述結(jié)果表明，AG處理可以抑制乙烯合成、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞壁降解相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制乙烯合成、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞壁降解，延緩桃果實(shí)成熟軟化。

圖3 5 mmol·L-1 AG處理黃水蜜桃果實(shí)乙烯合成和細(xì)胞壁降解相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.3 The expression of ethylene synthesis and cell wall-degrading related genes of Huangshuimi peach under the treatment of 5 mmol·L-1 AG

2.3 沉默PpCuAO4基因延緩桃果實(shí)成熟

為進(jìn)一步驗(yàn)證PpCuAO介導(dǎo)的多胺分解在桃果實(shí)成熟中的功能，采用VIGS技術(shù)沉默桃果實(shí)PpCuAO4基因，并分析果實(shí)成熟相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果顯示，與注射TRV2空載質(zhì)粒的對(duì)照果實(shí)相比，轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)注射部位呈現(xiàn)淺綠色，而對(duì)照果實(shí)注射部位著色與未注射部位無(wú)明顯差異(圖4-A)?；虮磉_(dá)分析顯示，轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)PpCuAO4的相對(duì)表達(dá)水平僅為對(duì)照的18%(圖4-B)。多胺含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因果實(shí)Put含量顯著高于對(duì)照組，而Spd和Spm含量略高于對(duì)照，但無(wú)顯著差異(圖4-C)，說(shuō)明沉默PpCuAO4后桃果實(shí)Put分解被顯著抑制，積累增加。桃果實(shí)硬度測(cè)定顯示，雖然對(duì)照和轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)采后硬度呈明顯下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因果實(shí)硬度在第1、第2、第3和第5天均顯著高于對(duì)照組(圖4-D)。轉(zhuǎn)基因和對(duì)照果實(shí)在采后7天內(nèi)乙烯釋放量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中在采后第1天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，但轉(zhuǎn)基因果實(shí)乙烯釋放量均低于對(duì)照水平，尤其是在采后第1天和第2天差異達(dá)到顯著水平(圖4-E)。呼吸強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果與乙烯釋放量類似，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照桃果實(shí)呼吸強(qiáng)度同樣呈先升高后降低的趨勢(shì)，在采后第1天達(dá)到呼吸高峰，隨后逐漸降低，但轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)呼吸強(qiáng)度始終低于對(duì)照水平，尤其是在采后第2 d轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)呼吸強(qiáng)度顯著低于對(duì)照水平(圖4-F)。上述試驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，沉默PpCuAO4基因可顯著抑制Put分解，降低果實(shí)軟化速度，同時(shí)降低乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度，從而延緩桃果實(shí)成熟。

注：A：沉默PpCuAO4基因桃果實(shí)表型觀察，TRV2為空載對(duì)照；B：轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)PpCuAO4表達(dá)分析；C：轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)自由態(tài)多胺含量測(cè)定；D～F：分別為轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)硬度、乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度測(cè)定。 Note: A: Phenotype of PpCuAO4-silenced peach fruit. TRV2 means empty vector. B: Expression level of PpCuAO4 in PpCuAO4-silenced and control peach fruits. C: Free polyamine concentration of PpCuAO4-silenced peach fruit. D～F: The firmness, ethylene release and respiration rate of PpCuAO4-silenced peach fruit, respectively.圖4 VIGS沉默PpCuAO4桃果實(shí)表型觀察及生理數(shù)據(jù)測(cè)定Fig.4 The phenotype and detection of fruit quality traits of PpCuAO4-silenced peach fruit

3 討論

現(xiàn)有研究表明外源Spd和Spm處理可以延緩桃和葡萄果實(shí)成熟衰老[11-12,15]，但會(huì)促進(jìn)草莓果實(shí)成熟[24]，而采用PAO抑制劑處理同樣可以促進(jìn)草莓果實(shí)著色和成熟[25-26]，由此可見(jiàn)多胺對(duì)果實(shí)成熟的調(diào)控作用十分復(fù)雜，在不同類型果實(shí)可能發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果表明，采用CuAO抑制劑AG處理能夠延緩桃果實(shí)成熟軟化，且呈現(xiàn)一定的濃度梯度效應(yīng)。為進(jìn)一步解析CuAO介導(dǎo)的多胺分解影響桃果實(shí)成熟的分子機(jī)理，本研究分析了AG處理后黃水蜜桃果實(shí)乙烯合成、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞壁降解相關(guān)基因表達(dá)水平，結(jié)果表明AG處理可顯著抑制乙烯合成、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞壁軟化相關(guān)基因表達(dá)水平。然而，PpCuAO4在桃果實(shí)成熟中的功能尚不明晰。由于桃目前尚無(wú)穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本研究采用VIGS技術(shù)瞬時(shí)沉默了桃果實(shí)PpCuAO4基因，結(jié)果表明敲除PpCuAO4基因后Put積累顯著增加，且采后轉(zhuǎn)基因桃果實(shí)軟化速度明顯延緩，乙烯釋放和呼吸作用均得到顯著抑制。VIGS結(jié)果充分說(shuō)明，PpCuAO4基因能夠通過(guò)促進(jìn)Put分解，從而正調(diào)控桃果實(shí)成熟。

隨著對(duì)多胺調(diào)控果實(shí)成熟功能研究的不斷深入，多胺在果實(shí)采后貯藏保鮮中的應(yīng)用也受到廣泛關(guān)注。其中，采用Put和Spd處理可以顯著改善葡萄貯藏品質(zhì)[27]，并且可以通過(guò)抑制果實(shí)的呼吸作用和增加細(xì)胞膜透性，延緩果實(shí)硬度、可滴定酸、可溶性固形物和抗壞血酸含量的下降，從而保持無(wú)核白葡萄貯藏品質(zhì)[28]；陳志遠(yuǎn)等[29-30]發(fā)現(xiàn)Spm可以改善藍(lán)莓果實(shí)貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)貯藏時(shí)間。上述研究結(jié)果表明，多胺不僅能夠影響果實(shí)成熟，而且能夠延緩采后果實(shí)衰老和品質(zhì)劣變，減少病害發(fā)生，從而改善貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期。然而，這些報(bào)道均通過(guò)施用外源多胺來(lái)達(dá)到增加多胺積累、延緩成熟衰老的目的，而通過(guò)減少果實(shí)多胺分解是否能夠達(dá)到同樣的效果尚不清楚。本研究通過(guò)外源CuAO抑制劑和敲除Put分解關(guān)鍵基因PpCuAO4基因均實(shí)現(xiàn)了增加Put積累和延緩桃果實(shí)成熟的目的，說(shuō)明CuAO在果實(shí)成熟發(fā)揮重要作用，并且通過(guò)抑制CuAO介導(dǎo)的多胺分解同樣可以延緩果實(shí)成熟，延長(zhǎng)貨架期。

與此同時(shí)，天然多胺提取復(fù)雜，且含量較低，而人工合成的多胺使用成本較高，嚴(yán)重制約了其在生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用[31]。本研究探究了CuAO抑制劑AG處理在延緩桃果實(shí)成熟軟化中的效果，結(jié)果表明AG處理具有較好的貯藏保鮮效果。同時(shí)，AG使用成本低，便于大范圍使用，具有作為果實(shí)貯藏保鮮劑使用的潛力。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)培育高品質(zhì)、耐貯運(yùn)的水果新品種正在成為一種趨勢(shì)。因此，進(jìn)一步挖掘多胺調(diào)控果實(shí)成熟衰老的關(guān)鍵基因可為未來(lái)作物遺傳改良提供重要的基因資源。

4 結(jié)論

本研究采用外源CuAO抑制劑AG處理證實(shí)了CuAO介導(dǎo)的多胺分解能夠促進(jìn)桃果實(shí)成熟，并利用VIGS技術(shù)進(jìn)一步證明了PpCuAO4基因可以通過(guò)促進(jìn)Put分解加速桃果實(shí)成熟，表明CuAO抑制劑AG具有作為一種桃果實(shí)貯藏保鮮劑的應(yīng)用潛力，同時(shí)PpCuAO4可以作為利用生物技術(shù)培育耐貯運(yùn)桃新品種的重要基因資源。