近紅外光譜法快速測(cè)定異煙肼片

[摘要] 目的 研究近紅外光譜法在異煙肼片快速測(cè)定中的應(yīng)用。 方法 應(yīng)用偏最小二乘法建立計(jì)算模型，通過(guò)方差分析法選擇計(jì)算波長(zhǎng)，主成分分析法選擇驗(yàn)證集和訓(xùn)練集，交互驗(yàn)證法選擇適當(dāng)?shù)挠?jì)算因子數(shù)。 結(jié)果 應(yīng)用所建立的偏最小二乘法模型，對(duì)9份異煙肼片測(cè)定異煙肼含量，與HPLC法相比，所測(cè)結(jié)果相對(duì)誤差≤±0.8%，方法準(zhǔn)確可靠。結(jié)論 可將近紅外光譜法應(yīng)用于異煙肼的快速測(cè)定，在異煙肼生產(chǎn)中的過(guò)程控制和快速質(zhì)量檢測(cè)上有較大應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]近紅外光譜；偏最小二乘法；異煙肼；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R945 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）20-88-03

美國(guó)FDA共批準(zhǔn)了10種治療結(jié)核的藥物，異煙肼就是4種最核心的一線治療藥物之一，異煙肼對(duì)結(jié)核桿菌有抑制和殺滅作用，其生物膜穿透性好，由于療效佳、毒性小、價(jià)廉、口服方便，故被列為首選抗結(jié)核藥；異煙肼也是第一個(gè)抗抑郁藥物，但因?yàn)檩^強(qiáng)的肝臟毒性而退出市場(chǎng)；異煙肼對(duì)結(jié)核分枝桿菌有高度選擇性，抗菌作用強(qiáng)，目前測(cè)定異煙肼含量的方法主要有間接分光光度法[1]、極譜法[2]、高效液相色譜法[1、3-4]、伏安法[5-6]、化學(xué)發(fā)光法[7-10]等，但這些方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)且常需要大量試劑。近紅外光譜技術(shù)（NIR）是近年迅速發(fā)展起來(lái)的綠色分析技術(shù)，利用近紅外光譜技術(shù)分析樣品具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確和成本較低，不破壞樣品，不消耗化學(xué)試劑，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，因此該技術(shù)受到越來(lái)越多人的青睞[11-12]，可廣泛用于藥品的理化分析。近紅外光譜由于吸收強(qiáng)度弱，吸收峰重疊嚴(yán)重，因此必須將光譜進(jìn)行數(shù)學(xué)方法處理后，才能對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行分析[13]。偏最小二乘法（PLS）能有效地降維，并消除自變量間可能存在的復(fù)共線關(guān)系，明顯改善數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度。本文應(yīng)用近紅外光譜法對(duì)異煙肼片中異煙肼含量進(jìn)行了定量分析。

1 儀器與試劑

紫外可見近紅外分光光度計(jì)（UV-3150，SHIMADZU Corporation，Japan），附件ISR-3100積分球，高效液相色譜儀（LC-2010，SHIMADZU Corporation，Japan），投入式恒溫水槽（NTT-2200P，RIKAKIKAI公司，Japan），Nucleosil C18（4.6mm×150mm，10μm）色譜柱（江申分離科技公司，大連）。

異煙肼片購(gòu)于成都錦華藥業(yè)有限公司，異煙肼對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，原料藥購(gòu)于浙江江北藥業(yè)有限公司；淀粉、蔗糖、糊精、羧甲基纖維素等輔料購(gòu)于成都市泰山薄膜包衣有限公司，均符合中國(guó)藥典2005年版規(guī)定。甲醇為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備樣品

按照約0.5%的間隔，在異煙肼80%～100%的含量范圍內(nèi)，將異煙肼和相關(guān)輔料賦形劑混合制成樣品共計(jì)41份，此外將9個(gè)批次的異煙肼片用研磨器研成粉末。分別按文獻(xiàn)[4]測(cè)定異煙肼片含量作為真實(shí)值。

2.2 光譜測(cè)量條件

在波長(zhǎng)1200～2500nm范圍，設(shè)置狹峰為12nm，掃描速度設(shè)為慢，以BaSO4為空白掃描3次，以其平均光譜譜值作為各樣品的光譜。由于溫度會(huì)對(duì)樣品光譜測(cè)定產(chǎn)生較大的影響，因此本實(shí)驗(yàn)的光譜數(shù)據(jù)在測(cè)定時(shí)均保持在熱水循環(huán)恒溫裝置控制溫度為（25±0.1）℃下。

2.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用偏最小二乘法（PLS）軟件建立模型，以訓(xùn)練集均方根誤差（RMSEC）、交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）、預(yù)測(cè)集均方根誤差（RMSEP）和交互驗(yàn)證中計(jì)算值與真實(shí)值回歸的相關(guān)系數(shù)（R）作為評(píng)價(jià)模型的指標(biāo)。其計(jì)算方法見文獻(xiàn)[14]。

3 結(jié)果

3.1 近紅外光譜

異煙肼近紅外光譜譜圖如圖1所示，異煙肼在近紅外區(qū)域峰形較為復(fù)雜，吸收較弱。為進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，我們采用方差分析法選擇合適的光譜區(qū)間，計(jì)算50份樣品在各個(gè)波長(zhǎng)下的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)、以RSD為縱坐標(biāo)作曲線如圖2。根據(jù)RSD形成的峰和谷將光譜分成圖2所示的6段。

3.2 驗(yàn)證集的選擇

在50份樣品中選擇其中13份作為驗(yàn)證集，其余37份作為訓(xùn)練集。作樣品近紅外光譜的第一、二主成分得分圖如圖3，可見異煙肼的第一主成分占解釋變量的79.18%，第二主成分占16.85%。為使計(jì)算模型更穩(wěn)健，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集具有代表性，所選擇的預(yù)測(cè)集樣品必須均勻分布在主成分得分圖中。

3.3 最佳光譜區(qū)間的選擇

我們?cè)跇?gòu)建模型時(shí)，為了避免將過(guò)多冗余信息引入，從而減弱光譜受各種非目標(biāo)因素的影響，我們盡可能將無(wú)關(guān)信息的變量去除，提高了所構(gòu)建模型的分辨率、靈敏度和運(yùn)算效率，選擇的光譜區(qū)域均與組分性質(zhì)相關(guān)性較強(qiáng)。以RMSECV、RMSEC、RMSEP和R四項(xiàng)指標(biāo)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察了不同波長(zhǎng)對(duì)模型的影響，計(jì)算結(jié)果見表1。如表1所示，在1323～1540nm和1200～2500nm的全波長(zhǎng)范圍，R值相對(duì)較高，RMSE值均相對(duì)較低，但RMSECV1323～1540nm波長(zhǎng)下明顯小于全波長(zhǎng)，全波長(zhǎng)R值也較1323～1540nm下小，綜合考慮，我們選擇了1323～1540nm為所構(gòu)建模型的計(jì)算波長(zhǎng)。

3.4 最佳因子數(shù)的確定

使用PLS法建立校正模型，使用主成分?jǐn)?shù)（又稱因子數(shù)）的選擇直接關(guān)系到模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力。如果使用主成分?jǐn)?shù)（又稱因子數(shù)）過(guò)多，則會(huì)將一些反映噪音的信息也摻入計(jì)算，降低模型的預(yù)測(cè)能力，若建立模型使用的主成分?jǐn)?shù)（又稱因子數(shù)）過(guò)少，則不能充分反映樣品的光譜信息。本文利用交互驗(yàn)證法計(jì)算得到的PRESS及RMSECV值來(lái)確定最佳因子數(shù)，PRESS和RMSECV的值越小，表明建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)能力越好。因子數(shù)和PRESS、RMSECV的相關(guān)性圖見圖4，如圖所示，最佳因子數(shù)為5。

3.5 最佳模型建立與樣品測(cè)定

選擇因子數(shù)為5，以1323～1540nm為模型計(jì)算波長(zhǎng)，建立最佳校正模型，以HPLC法分析結(jié)果作為真值，相對(duì)近紅外預(yù)測(cè)值作圖（圖5），所建模型R為0.99537，RMSEC為0.00451，RMSEP為0.00578。利用所建立模型測(cè)定9份異煙肼片中異煙肼含量，并與HPLC法測(cè)定值比較，結(jié)果列于表2，由表2所知，NIRS法與HPLC法所測(cè)值的相對(duì)誤差不大于0.796%，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

4 討論

本文應(yīng)用近紅外光譜，通過(guò)偏最小二乘法測(cè)定了異煙肼片中異煙肼的含量，與高效液相色譜法（HPLC）相比，測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差<±0.8%，方法準(zhǔn)確。近紅外光譜分析技術(shù)在近幾十年內(nèi)得到了快速的發(fā)展而且在多個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域得到了廣泛的認(rèn)可，它的魅力在于其可以在很短的時(shí)間內(nèi)無(wú)需復(fù)雜的樣品制備過(guò)程即可完成物質(zhì)成份多組分的同步快速定量分析，并且可以給出很高的分析精度，不產(chǎn)生任何化學(xué)污染且分析成本很低，易于在實(shí)驗(yàn)室尤其是工業(yè)現(xiàn)場(chǎng)或在線分析領(lǐng)域得到推廣使用。如果將近紅外光譜轉(zhuǎn)化成數(shù)字化光譜，利用適宜的數(shù)字化近紅外光譜建立的定量模型為解決所收集的海量近紅外光譜光譜的分類、管理和再利用提供了新的思路。

近紅外光譜分析技術(shù)能夠以無(wú)損的方式從樣本中直接獲取分析信息，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)其譜圖特征分類、鑒別及質(zhì)量控制進(jìn)行研究，對(duì)于藥材的定性鑒別、質(zhì)量控制具有十分重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。加上便攜式近紅外光譜儀的研制，近紅外光譜在快速、高效、無(wú)損分析方面將有很大的優(yōu)勢(shì)。

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（收稿日期：2013-08-30）