銀杏葉提取物對大鼠局灶性腦缺血后血管新生的影響

[摘要] 目的 探討銀杏葉提取物是否可以促進大鼠局灶性腦缺血后梗死周圍區(qū)的血管新生，尋求促使腦缺血后血管新生、開發(fā)腦儲備能力的有潛力的中醫(yī)藥療法。 方法 采用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，術(shù)后24h采用銀杏葉注射液以10mg/（kg體重·d）的劑量連續(xù)腹腔注射治療6d，于缺血后第7 d、14 天分別觀察銀杏葉組和對照組大鼠腦梗死體積、腦梗死灶周圍血管密度（層粘連蛋白，Laminin的表達）和神經(jīng)功能缺失評分的變化。 結(jié)果 與對照組比較，大鼠局灶性腦缺血后第7天和14 天銀杏葉組的梗死體積明顯減小，梗死周圍血管密度較對照組明顯增加，并顯示出更好的神經(jīng)功能評分（P<0.05）。 結(jié)論 銀杏葉提取物可促進局灶性腦缺血后大鼠腦梗死周圍區(qū)的血管新生，從而開發(fā)腦儲備能力，這可能是銀杏葉提取物改善腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的機制之一。

[關(guān)鍵詞] 銀杏葉提取物；腦缺血；血管新生

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）20-13-03

為探討銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extracts，EGb）是否可以促進大鼠局灶性腦缺血后梗死周圍區(qū)的血管新生，尋求促使腦缺血后血管新生、開發(fā)腦儲備能力的有潛力的中醫(yī)藥療法進行本研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～240g（廣州醫(yī)學院實驗動物中心提供）。隨機將大鼠分為銀杏葉組和對照組（各20只）各組又再分為腦缺血后7 d、14 d兩個時間點（各10只）。

1.2 大腦中動脈閉塞（MCAO）模型的建立

參照Zea Longa等[1]的線栓法略作改進。線栓采用直徑為0.20～0.24mm的尼龍栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司），頭端覆以硅酮（OV-101，上?；瘜W試劑站進口分裝）。

用6%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉，大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，取頸部正中切口，分離出左側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，結(jié)扎左側(cè)頸總、頸外動脈及其分支，于頸總動脈分叉處插入栓線約18～20mm至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈的血供來源，隨后以手術(shù)縫線固定栓線和頸內(nèi)動脈。

1.3 給藥方法

銀杏葉組：按動物體表面積劑量換算法，根據(jù)公式Db=Da×Rab（Db為所求劑量，Da為已知劑量，Rab為相應(yīng)動物體表面積換算系數(shù)。以60kg成人每日注射87.5 mg 藥物與200g大鼠體表面積換算比值換算出大鼠1d用量為10mg/kg體重，以此作為銀杏葉注射液（金納多注射液，德國威瑪舒培博士藥廠，含銀杏葉提取物17.5mg/支）的治療劑量。MCAO術(shù)后24h第1次腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)治療6d。對照組：以等量生理鹽水腹腔注射。

1.4 神經(jīng)功能評分

由不知道試驗分組的研究人用Bederson評分標準[2]進行神經(jīng)功能評價。離地面20cm處懸掛大鼠尾巴。前肢對著地面的正常反應(yīng)被評為0分。右肢向著身體彎曲和（或）右肩旋轉(zhuǎn)和肢體平分為不正常姿勢。當大鼠有不正常姿勢時，將其放置在一張軟的塑料紙上，大鼠可能用爪抓住塑料紙。為了使前肢滑動，從雙肩后面輕輕地給側(cè)面壓力，先右邊后左邊。如果兩個方向的側(cè)面壓力都有抗性被評為1分，左邊的側(cè)面壓力抗性減少被評為2分。自發(fā)逆時針轉(zhuǎn)圈或左側(cè)歪斜/不動評為3分。

1.5 腦梗死體積采用TTC 染色法

MCAO術(shù)后第7天 、14天各組隨機取5只大鼠，麻醉后快速斷頭，用生理鹽水沖凈血液，取出腦組織，放入-20℃冰箱10min，取出后，從視交叉開始，向前切取1 片，向后切取4 片2mm 厚的切片，共5片，放入1% TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑，國藥集團化學試劑有限公司）溶液中，嚴格避光，37℃恒溫孵育30min，15min時翻面，后移置10%甲醛中固定3h，無染色區(qū)為梗死組織，切片照相。

1.6 組織學標本采集

到時間點前麻醉大鼠（方法同前）后固定于手術(shù)臺上，到時間點即予PBS（0.01M，pH 7.4）心臟灌注5min處死，接著予4%多聚甲醛PBS行心臟灌注前固定20～30min，取腦后冠狀切取前囟前1mm至前囟后2mm的腦組織，浸泡于相同濃度的多聚甲醛4℃過夜作后固定。標本采用切片機（VT 1000S，Leica，Nussloch，Germany）行連續(xù)冠狀切片（片厚40μm），相鄰切片分為2套，分別用于免疫組化染色和HE染色。

1.7 免疫組織化學染色

切片予PBS充分漂洗（每次5min，共3次），0.3%過氧化氫PBS搖床上孵育30min；充分漂洗后于含10%羊血清、0.1% Triton X-100的PBS中孵育1 h以阻斷非特異性結(jié)合；加入兔抗laminin 多克隆抗體（1∶200，Sigma-Aldrich），稀釋液為含10%羊血清、0.1% Triton X-100的PBS，4℃孵育過夜；充分漂洗后加入生物素標記羊抗兔二抗（1∶200； Vector Laboratories），稀釋液為含10%羊血清的PBS，室溫孵育2h；充分漂洗后加入親和素-生物素復(fù)合物中室溫孵育1h；反應(yīng)產(chǎn)物用DAB顯色，自來水充分沖洗；脫水、透明后封片。

1.8 圖像分析和統(tǒng)計學處理

梗死體積用TTC無染色區(qū)與對側(cè)大腦半球百分比表示；毛細血管密度用laminin免疫陽性百分比表示，梗死灶周圍皮層（850μm×640μm）圖片在20倍的物鏡下，隨機選 3個視野，每個視野間距200μm，結(jié)果用3個視野的平均數(shù)表示。圖像分析用NIH Image J 1.38程序。所有數(shù)據(jù)以（）表示，應(yīng)用StatView5.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用t檢驗（unpaired t-test），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 梗死灶體積

TTC染色顯示在所有缺血大鼠中，大腦皮層梗死灶局限在左顳頂皮層及其皮質(zhì)下區(qū)。在MCAO術(shù)后7 d和14 d，銀杏葉組較對照組的梗死體積明顯減小，7d：（16.70±1.23）% vs （21.00±1.31）%；14 d：（12.80±1.47）% vs （17.30±1.35）%。見表1。

2.2 梗死灶周圍的血管新生

Laminin（層粘連蛋白）是血管基膜的標志。缺血后銀杏葉組laminin免疫反應(yīng)性逐漸增加，缺血后第7天、14天皮層梗死灶周圍的血管密度較對照組顯著增加。見圖1。

MACO術(shù)后7d和14 d，梗死周圍皮層血管密度比較，銀杏葉組比對照組明顯增加，缺血后7d：（12.00±1.14）% vs （8.22±0.47）%，t=3.063，P=0.0155；14d：（10.28±0.62）% vs （7.16±0.41）%， t=4.196，P=0.003。

2.3 神經(jīng)功能評分

與對照組比較，卒中發(fā)生后7d和14d銀杏葉組顯示更好的神經(jīng)功能評分，缺血后7d：（1.60±0.16） vs （2.50±0.17），14d：（0.50±0.17） vs （1.50±0.17）。見表2。

3 討論

近年來，我國的腦卒中發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其中缺血性卒中占腦卒中的60%～80%。在缺血性腦卒中的治療方面，人們越來越多地把目光投向了人體內(nèi)源性的腦儲備能力。其中，側(cè)支循環(huán)儲備中的血管新生能力因具有無限的潛力成為研究者關(guān)注的焦點。1994年，Krupinski等[3]對10例存活5～92d的腦梗死患者的腦組織切片進行研究，證實了缺血腦組織中微血管密度增加，且在卒中后7d即出現(xiàn)，其模式與正常腦組織的血管網(wǎng)非常相似。2006年美國的一項觀察MCAO后募集骨髓干細胞的研究進一步證實，缺血側(cè)會出現(xiàn)血管新生[4]。既然人體自身存在代償性的血管新生以改善缺血區(qū)的供血，人們便試圖給予外源性刺激激發(fā)人體的這一功能，治療性血管新生（therapeutic angiogenesis，TAG）即應(yīng)運而生。目前在心肌缺血和其他外周缺血性疾病中，治療性血管新生已進入臨床試驗階段甚至臨床應(yīng)用階段。由于缺血性腦卒中的特殊性，目前治療性血管新生還僅處于動物實驗階段。目前，治療性血管新生的研究主要集中在對血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）等的應(yīng)用上。但由于血管生成因子自身成分或基因治療中某些載體成分的安全性問題，血管生成因子的應(yīng)用還存在一定的風險：在誘導(dǎo)血管性新生的過程中可能促進腫瘤的生長；VEGF可能會引起糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視力衰退；病毒載體具有毒性及會引起炎癥性免疫反應(yīng)等。為了避免這些風險，科學家們想到了另外的途徑，就是通過給予刺激或藥物促進血管生成因子的產(chǎn)生。已有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可顯著提高內(nèi)源性VEGF水平，并增加循環(huán)中血管內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量而促進血管生成[5]。但其在急性卒中的療效和安全性尚未得到證實。而祖國傳統(tǒng)醫(yī)學——中醫(yī)藥由于具有良好的安全性而成為治療性血管新生研究中的熱點。

銀杏葉提取物是從銀杏葉中分離純化的提取物，因其作用范圍廣且不良反應(yīng)少而在缺血性心腦血管病的治療中得到廣泛應(yīng)用。EGb中的有效成分主要是黃酮苷類和萜類，它具有眾多的藥理作用：清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、拮抗血小板活化因子（PAF）、調(diào)節(jié)血管活性和增加血流量、降脂等。研究表明，腦缺血后EGb可以通過減輕線粒體功能衰竭、降低谷氨酸等毒性物質(zhì)的釋放、減少繼發(fā)性神經(jīng)細胞死亡/凋亡等機制起神經(jīng)保護作用，同時還有助于腦血流的恢復(fù)和減輕腦水腫[6-9]。但目前尚未見到有EGb應(yīng)用于腦缺血后治療性血管新生的研究。關(guān)于銀杏葉提取物與血管生成的關(guān)系，自1994年起已逐漸發(fā)現(xiàn)并證明EGb可以抑制血管生成、用于腫瘤的治療[10]。這是否意味著EGb不能用于促進血管新生呢？隨著腦缺血后治療性血管新生研究和中醫(yī)絡(luò)病理論的發(fā)展，人們提出了疑問：既然中藥可以抑制腫瘤性的血管生成，那么在不同的病理狀態(tài)，如腦缺血后可否用于促進血管的生成？中醫(yī)絡(luò)病理論認為，血管生成亢進的腫瘤和血管生成不足的缺血性疾病與中醫(yī)絡(luò)病的絡(luò)脈亢進和絡(luò)脈虛滯的理論相一致，通暢絡(luò)脈是絡(luò)病的治療總則，對于絡(luò)脈生成亢進，要在通絡(luò)的基礎(chǔ)上，抑制絡(luò)脈亢進，而對于絡(luò)脈生成不足，則要在通絡(luò)的基礎(chǔ)上，促進絡(luò)脈的生成。祖國醫(yī)學認為EGb具有補氣養(yǎng)血的功效，因而具有通絡(luò)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)其可增加腦缺血后血流量可能亦與其促血管新生有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)EGb可顯著增加外周血內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量及改善其粘附、增殖和體外血管生成能力[11]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，EGb對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX-1） mRNA表達升高有較強的拮抗作用，減輕其所致的內(nèi)皮細胞損傷[12]。因此，根據(jù)EGb的多種藥理活性，我們推測EGb是一個極具潛力的、有望應(yīng)用于治療性血管新生的中藥。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后經(jīng)銀杏葉提取物治療后梗死周圍皮層的血管密度明顯增加，并顯示出更好的神經(jīng)功能恢復(fù)，提示銀杏葉提取物可能通過促進局灶性腦缺血后大鼠腦梗死周圍區(qū)的血管新生，從而開發(fā)腦儲備能力，這可能是銀杏葉提取物改善腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)的機制之一，銀杏葉提取物有望應(yīng)用于腦缺血后的治療性血管新生。

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（收稿日期：2013-09-22）