兩型TNF—α及其受體在胸主動脈縮窄誘導(dǎo)壓力負(fù)荷心肌肥厚小鼠中的表達(dá)

[摘要] 目的 檢測壓力負(fù)荷所致心肌肥厚小鼠模型心肌組織中兩型TNF及其受體的表達(dá)。 方法 使用野生型BALB/c小鼠，將其分為假手術(shù)組（n=10只）和手術(shù)組（n=8只），通過胸主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型。術(shù)后2周處死小鼠，并對小鼠進(jìn)行心臟形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)檢測；使用Western Blot方法對心肌組織中兩型TNF-α及其受體表達(dá)進(jìn)行檢測。 結(jié)果 （1）在BALB/c小鼠中成功建立胸主動脈縮窄誘導(dǎo)心肌肥厚模型；（2）術(shù)后2周手術(shù)組小鼠心臟組織中可見分泌型TNF-α和跨膜型TNF-α表達(dá)量均有增加，且分泌型TNF-α表達(dá)量明顯高于跨膜型TNF-α，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；（3）術(shù)后2周小鼠心臟組織中TNFR1和TNFR2表達(dá)量均有增加，但TNFR1表達(dá)量高于TNFR2（P<0.05）。 結(jié)論 在小鼠壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚模型中，兩型TNF-α及其兩種受體表達(dá)量均有增加。雖然起負(fù)性肌力作用的分泌型TNF-α及TNFR1表達(dá)起主導(dǎo)作用，其研究相對集中且廣泛，但跨膜型TNF-α和TNFR2表達(dá)量增加提示其在這一病理過程中具有生物學(xué)作用。其作用和機制仍需進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 跨膜型腫瘤壞死因子-α；分泌型腫瘤壞死因子-α；腫瘤壞死因子受體；壓力負(fù)荷性心肌肥厚

[中圖分類號] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）20-09-04

[Key words] Transmembrane TNF-α； Secreted TNF-α； TNF-α receptor；Pressure-overload hypertrophy

心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過程是一個伴隨慢性炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的病理過程。心力衰竭患者體內(nèi)常伴有多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的高表達(dá)，通過影響心肌收縮力，引起心肌肥大，誘導(dǎo)心肌纖維化、凋亡和心臟重構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。其中，腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor

alpha，TNF-α）是眾多炎癥因子的關(guān)鍵分子之一[1]。早期研究證實TNF-α通過多種途徑在心肌肥厚和心力衰竭過程中扮演著重要的角色。雖然在大鼠和小鼠的心力衰竭模型中證實抗TNF-α抗體的抗心力衰竭作用是有效的，然而，在隨后開展的TNF-α拮抗劑治療心力衰竭大規(guī)模臨床試驗中卻沒有獲得理想的結(jié)果，甚至還提高了心力衰竭患者的住院率和死亡率[2]。因此，對TNF-α及其受體進(jìn)行更深入、細(xì)致的研究對于了解TNF-α及其受體在心力衰竭中的作用機制具有重要意義。本實驗旨在通過建立胸主動脈縮窄誘導(dǎo)心肌肥厚模型檢測兩型TNF-α：即分泌型腫瘤壞死（Soluble Tumor Necrosis Factor-α，sTNF-α），和跨膜型腫瘤壞死因子（Transmembrane Tumor Necrosis Factor-α，tmTNF-α）及其兩種受體：腫瘤壞死因子受體1（Tumor Necrosis Factor Receptor 1，TNFR1）和腫瘤壞死因子受體2（Tumor Necrosis Factor Receptor 2，TNFR2）的表達(dá)情況，從而為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡BALB/c野生小鼠購自于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組，每組10只小鼠，分別為：假手術(shù)組和手術(shù)組。室溫22～26℃，相對濕度50%～80%，每日光照12 h，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食，自由進(jìn)食與飲水。所有的實驗動物操作程序均符合NIH制定的實驗動物管理與使用指南的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 壓力負(fù)荷性心力衰竭小鼠模型建立

小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，取仰臥位固定。氣管插管接呼吸機，控制潮氣量2～3mL，呼吸頻率90～110次/min。剪毛后用碘氟消毒手術(shù)區(qū)域，以左側(cè)第二肋為中心在小鼠胸前行縱行切口剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，斷第二肋。使用開胸器撐開縱膈，分離胸腺，暴露主動脈弓。在右頸總動脈分出大約3mm并用7個零的絲線繞在主動脈弓處，用27g鈍性針頭放置于絲線和主動脈弓之間墊扎，以認(rèn)為制造出70%左右狹窄。確認(rèn)結(jié)扎后抽出針頭，逐層關(guān)閉縱膈。待小鼠自主呼吸恢復(fù)后，拔出氣管插管，放入飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)。假手術(shù)組過程同手術(shù)組，只是不進(jìn)行主動脈弓結(jié)扎。術(shù)后行小鼠心臟超聲和心功能檢查，確認(rèn)造模成功。

1.3 小鼠心臟超聲檢測

小鼠超聲影像檢測在上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院心血管實驗室進(jìn)行。使用儀器為配有30MHz高頻探頭的VisualSonic Vevo770型超聲儀（VisualSonics Inc.，Toronto，ON，Canada）。在使用異氟烷麻醉小鼠后，沿仰臥小鼠胸骨旁左室乳頭肌水平短軸和長軸切面采集左室圖像，同時在二維圖像引導(dǎo)下分別獲取5個以上連續(xù)心動周期M型超聲影像。根據(jù)采集影響使用軟件分析結(jié)果，分別得到心率（heart rate，HR），左室收縮末容積（LV end-systolic internal diameter，LVIDES），左室舒張末容積（LV end-diastolic internal diameter，LVIDED），左室后壁厚度（posterior end-diastolic wall thickness，PWT），室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVS），射血分?jǐn)?shù)（LV ejection fractions，EF），左室縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）等數(shù)據(jù)。

1.4 小鼠心臟功能檢測

按照說明書使用美國Millar Instrument公司PowerLab MPVS-300（Millar Pressure-Volume System）儀器和軟件檢測和分析小鼠心功能。首先給予小鼠腹腔注射戊巴比妥50mg/kg進(jìn)行麻醉，固定小鼠，去毛并消毒手術(shù)區(qū)域，取頸部正中切口剪開皮膚后，逐層鈍性分離組織，暴露并游離右頸總動脈約1cm。使用手術(shù)線將頸動脈遠(yuǎn)心端進(jìn)行結(jié)扎，小鼠動脈夾夾閉頸動脈近心端。在顯微鏡下用顯微剪沿頸總動脈以45度角剪開缺口，將前端帶有電極的P-V導(dǎo)管（SPR-839，Millar Instruments，Houston，TX）經(jīng)右頸總動脈缺口插入主動脈并延伸至左心室。通過壓力-容積傳導(dǎo)系統(tǒng)（Millar Instruments）記錄壓力-容積環(huán)圖形。連續(xù)記錄15min，以獲得穩(wěn)態(tài)的血流動力學(xué)數(shù)據(jù)。經(jīng)pressure-volume analysis分析軟件（PVAN）處理后，獲得心率（heart rate，HR）、左室收縮末壓（LV end-systolic pressure，ESP）、左室壓力最大上升速率（maximal rates of rise of ventricular pressure，dP/dt max）和左室壓力最大下降速度（maximal rates of decline of ventricular pressure，dp/dt min）等血流動力學(xué)數(shù)據(jù)。

1.5 Western Blot檢測心肌組織目的蛋白

用冰PBS漂洗后加入組織裂解液（1%NP 40，0.15% 脫氧膽酸鈉，1%SDS，1%PMSF），用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。加熱變性、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5% 脫脂奶粉封閉1小時，以1︰250濃度的TNF抗體4℃孵育過夜。TBST洗膜后，二抗溫育1h，ECL顯色，曝光。采用Gel-pro軟件系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計方法

使用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，數(shù)值用（）表示，結(jié)果之間分析使用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野生型Babl/c小鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型的建立

首先使用野生型Babl/c小鼠進(jìn)行胸主動脈縮窄手術(shù)，制作壓力負(fù)荷性小鼠心肌肥厚模型。在術(shù)后2周進(jìn)行心臟形態(tài)學(xué)和血流動力學(xué)檢測。由圖1可見，胸主動脈所致心肌肥厚模型手術(shù)組小鼠心臟外觀（在體）較假手術(shù)組小鼠有明顯增大。手術(shù)組心臟體重（4.083±0.290）mg/g，相對于假手術(shù)組（5.19±0.52）mg/g，也明顯升高（圖1）。

超聲心動圖（圖2）顯示手術(shù)組小鼠左室舒張末期內(nèi)徑（3.02±0.80）mm，小于假手術(shù)組小鼠（3.31±1.10）mm，手術(shù)組左室后壁厚度（0.76±0.01）mm大于假手術(shù)小鼠（0.67±0.02）mm。在射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)方面，雖然手術(shù)組均值低于假手術(shù)組（Sham：EF：83.16%±1.90%，F(xiàn)S：52.53%±1.60%；TAC：EF：80.91%±2.10%，F(xiàn)S：51.03%±2.10%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

處死小鼠前使用Millar導(dǎo)管檢測心臟血流動力學(xué)改變，結(jié)果如表1顯示：假手術(shù)組與正常組在心率無明顯差異。左室舒張末期壓力（LVEDP）手術(shù)組明顯高于假手術(shù)組[Sham：（5.48±0.15）mm Hg，TAC：（12.227±0.310）mm Hg]，但是在反應(yīng)心臟收縮舒張功能的左室壓力變化最大速率（dP/dtmax）和左室壓力變化最小速率（-dP/dtmin）兩項指標(biāo)中，手術(shù)組[dP/dtmax：（5627±193）mm Hg/s，-dP/dtmin：（4427±225）mm Hg/s]明顯低于假手術(shù)組[dP/dtmax：（7127±312）mm Hg/s，-dP/dtmin：（6115±358）mm Hg/s]。

表1胸主動脈縮窄術(shù)后2周，假手術(shù)組與手術(shù)組血流動力學(xué)指標(biāo)。自上而下依次為：心率；左室舒張末壓力；左室壓力最大上升速率；左室壓力最大下降速率。通過以上實驗結(jié)果，證實胸主動脈縮窄術(shù)可以在2周時誘導(dǎo)明顯壓力負(fù)荷性心肌肥厚，增加室壁厚度，減少左室內(nèi)徑和容積，降低心肌收縮/舒張功能。接下來的實驗都以2周作為心肌肥厚時間點進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.2 野生型Babl/c小鼠在壓力誘導(dǎo)心肌肥厚時TNF-α受體的表達(dá)情況

通過提取心臟組織蛋白進(jìn)行Western Blot檢測壓力誘導(dǎo)性心肌肥厚小鼠心臟組織中兩種TNF-α受體表達(dá)，從而了解在心力衰竭初期TNF-α受體變化情況。結(jié)果顯示，假手術(shù)組TNFR1和TNFR2表達(dá)量均很低，而在手術(shù)組小鼠心臟組織中TNFR1和TNFR2表達(dá)量都明顯高于假手術(shù)組，但TNFR1表達(dá)要高于TNFR2。見圖3。

2.3 野生型Babl/c小鼠在壓力誘導(dǎo)心肌肥厚時兩型TNF-α表達(dá)情況

Western Blot檢測心臟組織中兩型TNF-α：tmTNF-α和sTNF-α表達(dá)情況。由圖4可見，假手術(shù)組中兩型TNF-α表達(dá)量均較低，TAC術(shù)后2周兩型TNF-α表達(dá)量均較假手術(shù)有明顯增加，但sTNF-α表達(dá)較tmTNF-α表達(dá)量更多。

3 討論

胸主動脈縮窄術(shù)可以成功模擬慢性壓力負(fù)荷性心力衰竭，與人類慢性高血壓導(dǎo)致的慢性心力衰竭的病理生理過程相似。胸主動脈縮窄術(shù)建立是經(jīng)典的壓力超負(fù)荷慢性心衰模型，其機制是通過縮窄主動脈弓，使主動脈壓力升高，心臟后負(fù)荷增加，心肌代償性肥厚，后期出現(xiàn)心臟容積增加、心臟擴大，最終心臟失代償發(fā)展為心力衰竭。文獻(xiàn)報道胸主動脈縮窄術(shù)后2～3周可出現(xiàn)代償性心肌肥厚，主要表現(xiàn)為室壁增厚，心室腔減小，心臟收縮功能甚至增加；而到后期（術(shù)后4～6周）則會出現(xiàn)室壁厚度降低、心室腔擴大、收縮舒張功能降低等心力衰竭表現(xiàn)。本實驗通過該手術(shù)方式造成一定程度胸主動脈縮窄，術(shù)后2周通過心臟超聲及心功能檢測證實，成功建立了慢性心肌肥厚模型。

TNF-α是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，是最早被發(fā)現(xiàn)具有殺傷腫瘤作用的細(xì)胞因子之一。1998年Kriegler等[3]發(fā)現(xiàn)除sTNF-α以外，還存在tmTNF-α。目前關(guān)于兩型TNF-α研究仍多集中于sTNF-α，而對tmTNF-α的作用研究較少且多集中于腫瘤方面的研究。例如：tmTNF-α比sTNF-α殺傷腫瘤的種類更廣泛，且可以殺傷對sTNF-α耐受的腫瘤細(xì)胞等[4]。TNF的受體包括TNFR1和TNFR2，二者胞外段結(jié)構(gòu)相似，但胞內(nèi)段卻截然不同，故介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)[5]。sTNF-α的主要生物學(xué)效應(yīng)由TNFR1介導(dǎo)，而tmTNF-α對TNFR2的親和力明顯高于sTNF-α，這可能是兩型TNF-α生物學(xué)活性不同的重要原因[6-7]。

目前TNF-α及其受體在心力衰竭方面研究更多的是sTNF-α和TNFR1，而對于tmTNF-α和TNFR2在慢性心力衰竭中的作用和機制的研究還非常有限。在心臟特異性高表達(dá)tmTNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中，心肌橫斷面積和心肌膠原含量都會增加，從而發(fā)展為向心性心肌肥厚。然而，在心臟特異性高表達(dá)sTNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠中，則會發(fā)展為左室擴大，心肌膠原含量減少，從而發(fā)展為左室心肌擴張[8]。有研究報道TNFR1主要介導(dǎo)心肌細(xì)胞毒作用和損害作用，TNFR2主要介導(dǎo)心肌的保護(hù)作用[9-10]。在大鼠急性心肌梗死和缺血冉灌注模型中，通過在局部缺血心肌處注入表達(dá)可溶性TNFR1的質(zhì)?？梢砸种芓NF生物學(xué)活性，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌梗死面積[11-12]。在TNF受體敲除的大鼠急性心肌梗死模型中，發(fā)現(xiàn)早期心肌梗死中內(nèi)源性TNF可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡起心臟保護(hù)作用[13]。由于TNF-α及其受體的多樣性、復(fù)雜性、交叉性及其在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的重要性，有必要對其進(jìn)行更全面更深入的研究。

在本實驗中，通過超聲心動圖和心功能檢測證實我們成功建立了胸主動脈縮窄誘導(dǎo)的壓力負(fù)荷性小鼠心肌肥厚這一經(jīng)典動物模型，并初步檢測了術(shù)后2周時假手術(shù)組和手術(shù)組小鼠心肌組織中兩型TNF-α及其受體的表達(dá)情況。通過以上實驗我們證實：在BALB/c小鼠中，相對于假手術(shù)組，胸主動脈縮窄術(shù)后2周可以出現(xiàn)明顯的心肌肥厚；而在該模型中相對于假手術(shù)組來說，手術(shù)組小鼠心肌組織中sTNF-α和tmTNF-α表達(dá)量均有明顯增加，但sTNF-α增加較tmTNF-α增加更為明顯；同樣，手術(shù)組小鼠心肌組織中兩種TNF-α受體表達(dá)也較假手術(shù)組明顯增加，但TNFR1表達(dá)量較TNFR2表達(dá)更多。有文獻(xiàn)報道，相對于野生組小鼠，心肌特異性高表達(dá)sTNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠4周時可發(fā)生心肌肥厚，而12周時小鼠心臟發(fā)生明顯心肌擴張[13]。與我們的實驗結(jié)果一致，TAC術(shù)后兩周心肌肥厚（代償期），此階段以上調(diào)sTNF/TNFR1為主，其對心肌細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)作用在該病理過程中起了更為主導(dǎo)的作用。然而，由于tmTNF-α是TNFR2的主要配體[5]，我們推測：tmTNF-α與TNFR2結(jié)合可能介導(dǎo)了部分心肌保護(hù)。而對于兩型TNF-α及其受體相互關(guān)系和作用，及其下游信號中對心肌肥厚相關(guān)信號分子（如JNK，ERK，MAPK及NFκB等）調(diào)節(jié)和影響需要進(jìn)一步探索和研究。從中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵通路和關(guān)鍵因子，從而為解決臨床試驗中出現(xiàn)的問題提供解決方案和新的思路。

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（收稿日期：2013-08-09）