櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)范

0 前言

果樹由于長期進行營養(yǎng)繁殖，使各類病毒病不斷擴散蔓延，并日趨嚴(yán)重，造成樹體生長不良、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、樹體異常，給生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。從20世紀(jì)80年代開始，我國大量從國外引進歐洲甜櫻桃（Prunus avium L.）品種，由于盲目引進，也帶進了一些嚴(yán)重影響櫻桃生長發(fā)育的病毒病。隨著歐洲甜櫻桃在我國的大面積推廣栽培與無序的苗木繁殖，加速了病毒在不同植株間的傳播，促進了病毒在植物體中的增殖和積累，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟價值。美國、加拿大和英國的歐洲甜櫻桃都曾因病毒病危害而減產(chǎn)30%以上，嚴(yán)重者全園崩潰。李屬壞死環(huán)斑病毒侵染歐洲甜櫻桃可使果園產(chǎn)量明顯下降，減產(chǎn)25%～50%，有些株系減產(chǎn)在50%以上，如果兩種以上病毒復(fù)合侵染歐洲甜櫻桃，減產(chǎn)幅度更大。據(jù)國外報道，櫻屬病毒主要有68種，其中可以侵染歐洲甜櫻桃的病毒約有34種，比較常見的歐洲甜櫻桃病毒主要有20種。

國內(nèi)自開展櫻桃病毒病的研究以來，已經(jīng)先后檢測并報道了7種病毒，分別是李矮縮病毒（Prune dwarf virus，PDV）、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus， PNRSV）、櫻桃小果病毒（Little cherry virus， LChV）、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus， CGRMV）、櫻桃病毒A（Cherry virus A， CVA）、櫻桃壞死銹斑病毒（Cherry necrotic rusty mottle virus， CNRMV）、蘋果褪綠葉斑病毒。目前已初步明確了國內(nèi)櫻桃主產(chǎn)區(qū)病毒病的種類、危害，并在病毒檢測方面取得了一定的進展。至今對植物病毒病尚無有效的治療方法，只能通過培育無病毒苗木來達到預(yù)防目的。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)界定了櫻桃無病毒苗木繁育技術(shù)規(guī)范的術(shù)語和定義，規(guī)定了櫻桃無病毒原種圃和母本圃建立、櫻桃無病毒苗木繁育、病毒檢測及監(jiān)測、苗木出圃、貯運的方法等。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于櫻桃無病毒苗木的生產(chǎn)與銷售。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB 9847 蘋果苗木

GB 19175 桃苗木

3 術(shù)語和定義

GB9847和GB19175界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1 櫻桃無病毒苗木

不攜帶李矮縮病毒（Prune dwarf virus， PDV）、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus， PNRSV）、櫻桃小果病毒（Little cherry virus， LChV）、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus， CGRMV）、櫻桃病毒A （Cherry virus A， CVA）、櫻桃壞死銹斑病毒 （Cherry necrotic rusty mottle virus， CNRMV）、蘋果褪綠葉斑病毒 （Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）的櫻桃苗木。

3.2 櫻桃無病毒原種

經(jīng)有資質(zhì)的專業(yè)機構(gòu)檢測，確定不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定病毒的原始植株。

3.3 櫻桃無病毒母本圃

用于提供櫻桃無病毒枝條、種子等繁殖材料的圃地。

4 無病毒原種圃的建立

4.1 脫毒材料母株要求

選取已經(jīng)進入盛果期，經(jīng)3年以上觀察，品種純正、生長健壯、外觀無異常的植株作為待脫毒材料。

4.2 脫毒

4.2.1 微莖尖培養(yǎng)脫毒法 （1）早春，從預(yù)選的植株上隨機切取剛萌動變綠尚未展葉的飽滿芽，或3—5月剪取抽生的嫩莖尖，去葉后作為外植體。

（2）用洗滌劑水浸3分鐘后，流水沖洗10分鐘，轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，70%酒精浸泡6秒，2%次氯酸鈉滅菌10～20分鐘，無菌水沖洗3次。

（3）解剖鏡放置在超凈臺上，用棉球蘸消毒酒精擦拭手及臺面，點燃酒精燈，將大小鑷子灼燒消毒。將鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿放置在解剖鏡臺上，用鑷子取出上述切取的材料，利用解剖針在解剖鏡下剝除其外部葉原基，切取1.0毫米以下莖尖分生組織（帶1～2片葉原基），用無菌濾紙吸干水。

（4）將外植體接種于MS接種培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫下培養(yǎng)，每天光照2000～3000勒克斯14小時，黑暗10小時，誘導(dǎo)叢生芽。

（5）叢生芽生長到1～3厘米高時，從其上切取0.3毫米以下莖尖分生組織，接種在MS接種培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽。

（6）將叢生芽或帶1～2個芽的莖端轉(zhuǎn)入MS繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3周后，取苗高2厘米以上的新梢轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，弱光處理5天后，轉(zhuǎn)入光下誘導(dǎo)生根。

（7）將試管苗移栽于溫室，成活后檢測。

4.2.2 熱處理法脫毒技術(shù) （1）櫻桃品種盆栽苗脫毒。將盆栽苗放入人工氣候室，光照強度10000勒克斯（1x）以上，32℃起始溫度下預(yù)培養(yǎng)3天后，黑暗溫度恒定32℃，白晝溫度每1天增加1℃，達到37℃時，保持在白晝37℃ 16小時/天、黑暗32℃ 8小時/天、濕度60%～80%條件下，變溫?zé)崽幚?8天。剪取新梢頂部0.5～1.0厘米，嫁接到無病毒砧木上，成活后檢測。

（2）櫻桃砧木試管苗脫毒。選擇繼代培養(yǎng)4～5代增殖能力強的無性系，熱處理方法參見（1），變溫處理18天后，剝?nèi)?.4毫米大小莖尖進行組織培養(yǎng)和繼代擴繁，并進行檢測。

待脫毒材料可直接經(jīng)過病毒檢測，篩選無病毒材料。

4.3 無病毒原種的確定

應(yīng)經(jīng)有資質(zhì)的檢測機構(gòu)檢測認(rèn)證，確定不帶上述7種病毒后，即可作為無病毒原種進行保存。

4.4 無病毒原種保存

原種保存圃與普通果園或苗圃應(yīng)相距100米以上、搭建300目紗網(wǎng)網(wǎng)室，封閉覆蓋全圃，出入口設(shè)緩沖間。網(wǎng)室內(nèi)土壤隔離覆蓋。定植在花盆中，盆內(nèi)土壤高溫消毒，每個無病毒品種應(yīng)保存3株以上，每株編號、掛牌標(biāo)識，繪制定植圖。加強肥水管理，保證樹勢健壯。

無病毒原種圃常用工具要專用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用70%酒精溶液消毒。工作人員進入無病毒原種圃前更換工作服。

4.5 建立檔案

建立櫻桃無病毒原種保存圃檔案。記載品種、砧木的中文名稱、外文名稱、品系、株系；引進單位、來源、時間，脫毒、病毒檢測的單位、時間及每年的觀察記錄等。

5 無病毒母本圃建立

5.1 無病毒母本圃地選擇

母本圃地應(yīng)選擇未曾栽植過果樹的地塊。全圃封閉覆蓋300目紗網(wǎng)，與普通果園或苗圃的距離應(yīng)大于100米。

5.2 無病毒母本圃設(shè)計規(guī)劃

建圃前按品種采穗圃、砧木采種圃和無性系砧木圃進行區(qū)劃。設(shè)計好排灌系統(tǒng)、道路、建筑物等，并進行土地平整、土壤改良和土壤消毒。

5.3 無病毒母本圃苗木來源

無病毒母本圃所采用的繁殖材料應(yīng)全部直接來自櫻桃無病毒原種保存圃。準(zhǔn)確記載品種、砧木、原母株株系；脫毒、病毒檢測的單位、時間等。

5.4 無病毒母本圃定植

無病毒品種采穗圃和砧木采種圃株行距為1～2米×2～4米；無性系砧木圃株行距為0.5～1米×2～3米。按品種成行栽植，同一品種栽植在一起，定植后繪制定植圖，做好標(biāo)記，不得混雜。每株母本樹都要賦予一個唯一的編號。編號由品種名稱、原種圃母株株系編號和本株的編號共同組成。按照編號給每株母本樹掛牌。

5.5 無病毒母本圃管理

（1）加強母本圃肥水管理和病蟲害防治，保證樹勢健壯，無早期落葉現(xiàn)象。

（2）無病毒無性系砧木圃的樹體，應(yīng)每年短截更新，其方法與普通無性系砧木母株相同。不允許在母本圃嫁接。

（3）無病毒母本圃常用工具要專用，剪枝剪等修剪工具每株使用前用70%酒精溶液消毒。

6 無病毒苗木繁育

6.1 苗圃建立

6.1.1 苗圃地選擇 選擇地勢平坦，排灌方便，土壤肥沃，壤土、沙壤土質(zhì)，土壤酸堿度適中，沒有栽植過果樹及果樹苗木的地方。苗圃應(yīng)距離普通果園、苗圃3000米以上，或全圃封閉覆蓋100目防蟲網(wǎng)、距普通果園及苗圃50米以上。

6.1.2 苗圃規(guī)劃和建設(shè) 苗圃應(yīng)劃分為若干小區(qū)。規(guī)劃出實生苗播種區(qū)、無性系砧木繁殖區(qū)、成苗培養(yǎng)區(qū)等。按規(guī)劃設(shè)計出各級道路、排灌系統(tǒng)，并統(tǒng)籌安排。平整土地，改良土壤，土壤消毒及增施有機肥。

6.2 實生砧木苗培育

砧木種子應(yīng)采自無病毒母本圃。采種后標(biāo)記其母株編號，并即刻沙藏，秋季或早春播種。播種前施用殺菌劑和殺蟲劑，進行土壤消毒。播種時按照母株編號分別播種，并繪制各株系分布圖，田間插牌標(biāo)記，不得混雜。其他管理同普通苗圃。

6.3 無性系砧木苗培育

6.3.1 材料來源 無性系砧木繁殖材料，應(yīng)來自無病毒母本圃。繁殖材料應(yīng)分別掛牌標(biāo)記其母株編號，按照品種及母株編號分別繁殖。繪制各品種及株系分布圖，田間插牌標(biāo)記，不得混雜。

6.3.2 繁殖方法 （1）壓條、分株繁殖法：從無病毒母本圃植株上直接進行壓條、分株繁殖的砧木自根苗，在苗圃栽植后再埋干壓條繁殖無病毒砧木苗。（2）組織培養(yǎng)法：組織培養(yǎng)方法繁殖砧木苗木，繼代次數(shù)不超過7代。（3）扦插繁殖法：用綠枝扦插、硬枝扦插等方法繁殖無病毒砧木。

6.4 嫁接

6.4.1 接穗采集 接穗應(yīng)采自無病毒母本圃。采集接穗的枝條生長健壯、芽體飽滿、無早期落葉、無病害。采集的接穗應(yīng)在陰涼處立即剪去葉片。按品種扎成捆，掛牌標(biāo)記母株編號。接穗存放同普通櫻桃接穗。

6.4.2 嫁接 應(yīng)分品種及不同母株分別嫁接。采用帶木質(zhì)部芽接法嫁接，嫁接位置距地面10～20厘米處。嫁接后應(yīng)按品種及母株編號分別記載。補接時，應(yīng)與原來嫁接的接穗來源相同。

6.5 苗圃管理

加強土肥水管理與病蟲害防治，保持苗木健壯生長、無早期落葉現(xiàn)象。

7 病毒檢測及監(jiān)測

7.1 病毒檢測方法

7.1.1 木本指示植物檢測法 李矮縮病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒、櫻桃小果病毒、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒、櫻桃壞死銹斑病毒、蘋果褪綠葉斑病毒可以采用木本指示植物檢測法進行檢測。

7.1.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA） 能獲得抗血清的櫻桃病毒可以采用A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法（PAS-ELISA）進行檢測。

7.1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法 李矮縮病毒、李屬壞死環(huán)斑病毒、櫻桃小果病毒、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒、櫻桃病毒A、櫻桃壞死銹斑病毒、蘋果褪綠葉斑病毒均可以采用RT-PCR方法進行檢測。

7.2 無病毒原種的監(jiān)測

無病毒原種圃的每株樹，經(jīng)常進行田間目測，每年經(jīng)國家有資質(zhì)的病毒檢測單位進行1次病毒檢測，發(fā)現(xiàn)攜帶病毒植株，應(yīng)連同容器立即清除。

7.3 無病毒母本圃的監(jiān)測

在生長期，應(yīng)每月對無病毒母本圃植株的表現(xiàn)癥狀進行全面的觀察，發(fā)現(xiàn)異常立即檢測。每2年對每株母本樹進行1次病毒檢測。發(fā)現(xiàn)帶毒植株立即清除，并進行局部土壤消毒。

7.4 無病毒苗木監(jiān)測

7.4.1 觀察 每年在生長季節(jié)對無病毒苗木進行2次全面觀察，發(fā)現(xiàn)有病毒癥狀，立即拔除帶毒植株及相鄰植株。

7.4.2 病毒檢測 每年苗木出圃前，應(yīng)進行1次病毒檢測，1‰抽檢，隨機取樣。若檢測出病毒，根據(jù)編號進行追溯，對其母本樹進行檢測。若母本樹帶毒，應(yīng)將帶毒母本樹繁殖的所有苗木及相鄰苗木銷毀或按普通苗木處理；若母本樹不帶毒，將攜帶病毒苗木及相鄰苗木銷毀，或按普通苗木處理。

8 苗木出圃、貯運

8.1 苗木出圃時間

宜在苗木停止生長、葉片開始脫落至翌年春季萌芽前出圃。土壤上凍時不要挖苗。

8.2 苗木檢疫

挖苗前，應(yīng)到縣、區(qū)植物檢疫站進行檢疫，并辦理檢疫證書。

8.3 挖苗

在挖苗前一天把即將落葉的苗木葉片全部抹除（帶葉栽植除外）。苗木主要根系要挖齊全，盡量減少根系和苗干受傷。苗木挖好后，應(yīng)及時分級、扎捆。

8.4 苗木的標(biāo)簽、包裝、貯運、假植

同普通櫻桃苗木。