次氯酸鈉在甘蔗開放式組培苗繁殖中的應(yīng)用研究

李松，劉欣，劉紅堅，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，淡明，劉麗敏，何毅波，張偉珍

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧530007）

次氯酸鈉在甘蔗開放式組培苗繁殖中的應(yīng)用研究

李松，劉欣，劉紅堅，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，淡明，劉麗敏，何毅波，張偉珍

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧530007）

以常規(guī)組培方式獲得的新臺糖22號無菌繼代苗為材料，將不同濃度的次氯酸鈉溶液加入到培養(yǎng)基中，研究次氯酸鈉在甘蔗開放式組織培養(yǎng)的有效濃度，以及增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的最佳濃度。結(jié)果表明，次氯酸鈉濃度在800mg/L以上可有效抑制培養(yǎng)基的污染，組培苗的增殖系數(shù)以900～1000mg/ L較好，生根效果以1000～1100mg/L為佳。結(jié)論：在甘蔗開放式培養(yǎng)中，次氯酸鈉的濃度以1000mg/L為宜。

甘蔗；次氯酸鈉；開放式組織培養(yǎng)

甘蔗是我國重要的糖料作物，其種植面積、產(chǎn)糖量均占全國總量的90%左右。甘蔗屬無性繁殖作物，生長時間長、用種量大，其繁殖速度慢，大大抑制新良種的推廣應(yīng)用速度。植物組織培養(yǎng)具有節(jié)省大量的空間及時間，培養(yǎng)過程不受外在環(huán)境因子的影響，且終年均可進行等優(yōu)點，常被廣泛推廣與應(yīng)用于無病毒苗大量繁殖、誘變育種、轉(zhuǎn)基因、次生代謝物生產(chǎn)、人工種子等領(lǐng)域，并產(chǎn)生巨大效益。近30年來在甘蔗新品種推廣過程中，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)推廣一大批甘蔗新良種，并產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益。但組培技術(shù)對無菌環(huán)境有嚴格要求，例如無菌操作臺、生物安全柜或高壓滅菌鍋等配套措施，都是圍繞防止污染而制定的。而影響污染的因素多種多樣，如外植體的種類，取材的季節(jié)、時間，頂處理方法，消毒藥劑的種類、濃度，消毒時間以及消毒方法；培養(yǎng)基和器皿滅菌，操作人員、工作環(huán)境的要求，超凈工作臺的工作質(zhì)量等都與污染緊密相關(guān)。因此，污染問題成為限制組培產(chǎn)業(yè)化的重要原因之一，也使組培技術(shù)應(yīng)用范圍受到極大的限制，不利于在常規(guī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣與普及。因此，簡化組織培養(yǎng)技術(shù)、防止污染成了組培研究中不可或缺的主要工作。

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)技術(shù)要求嚴格的無菌條件，需大量的設(shè)施設(shè)備及繁雜的操作程序，生產(chǎn)成本高[1]，使該技術(shù)的推廣受到較大的限制。植物開放式組織培養(yǎng)，是在殺菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴格無菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺，利用塑料杯代替組培瓶，在自然、開放的有菌環(huán)境中進行植物的組織培養(yǎng)，從根本上簡化組培環(huán)節(jié)，降低組培成本[2]。日本等國開放組培已廣泛應(yīng)用于菊花及蘭花等觀賞植物的組織培養(yǎng)中[3]，我國科研工作者在植物開放式組織培養(yǎng)中進行了大量研究[4]，并在荸薺[5]、白菜[6]、香蕉[7-8]、魔芋[9－10]、紅豆杉[11]、梅花[12]、馬鈴薯[13]、煙草[14]等植物研究中建立了開放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系，但甘蔗中未見有相關(guān)報道。本研究通過在甘蔗組織培養(yǎng)增殖、生根階段培養(yǎng)基中添加不同濃度的次氯酸鈉溶液，以期建立甘蔗的開放組培體系，簡化組培步驟，降低工廠化生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘蔗材料為新臺糖22號莖尖增殖苗；次氯酸鈉為通過供應(yīng)商購買，有效濃度為10%。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的準備開放式組培增殖與生根培養(yǎng)基選用傳統(tǒng)甘蔗組培苗生產(chǎn)中普遍使用的MS培養(yǎng)基配方[15]，培養(yǎng)基為液體，開放組培的培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8時加入一定濃度次氯酸鈉溶液，不經(jīng)過高溫高壓滅菌，充分攪拌培養(yǎng)基，定量分裝入潔凈的玻璃瓶中封口備用。對照組培養(yǎng)基按常規(guī)方法進行高壓滅菌。

1.2.2 開放式培養(yǎng)接種選擇相對獨立的普通實驗室作為接種室，使用前用濃度70%的酒精噴灑接種室自然落菌，再用紫外燈照射0.5h。接種過程與傳統(tǒng)組培接種方法相同。

1.2.3 添加不同濃度次氯酸鈉培養(yǎng)基的污染率試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別加入次氯酸鈉，A1：0、A2：10、A3：50、A4：100、A5：200、A6：400、A7：600、A8：800、A9：1000、A10：1200、A11：1400、A12：1600、A13：1800 mg/L，以常規(guī)高壓消毒培養(yǎng)基不添加次氯酸鈉為對照ACK。培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每個處理40瓶，3次重復，分裝后蓋好瓶蓋放在培養(yǎng)室觀察；20d后觀察并記錄污染瓶數(shù)，統(tǒng)計污染率；隨后在上述未污染培養(yǎng)基中接入常規(guī)無菌增殖組培苗，20d后觀察并記錄污染瓶數(shù)，統(tǒng)計污染率。

污染率＝污染瓶數(shù)/接種總瓶數(shù)×100%。

1.2.4 增殖培養(yǎng)次氯酸鈉濃度的篩選在空白試驗基礎(chǔ)上，采用增殖培養(yǎng)基MS+6BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/ L+蔗糖30g/L，添加次氯酸鈉溶液進行次氯酸鈉濃度的篩選，其濃度梯度設(shè)置為B1：800、B2：850、B3：900、B4：950、B5：1000、B6：1050、B7：1100、B8：1150、B9：1200mg/L，接種時采用開放式方法。以經(jīng)過高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基為對照BCK，超凈工作臺接種。每個處理培養(yǎng)40瓶，每瓶接種2叢、每叢5株左右的增殖苗，3次重復。20d后觀察并記錄增殖的苗數(shù)，統(tǒng)計增殖系數(shù)和增殖率。選取蔗苗增殖系數(shù)高的次氯酸鈉濃度為甘蔗開放組培增殖培養(yǎng)的最佳濃度。

增殖系數(shù)=試驗后每瓶苗數(shù)/試驗前每瓶苗數(shù)（不含污染瓶苗數(shù)）；增殖率=試驗后總苗數(shù)/試驗前總苗數(shù)（含污染瓶苗數(shù)）×100%。

1.2.5 生根培養(yǎng)次氯酸鈉濃度的篩選生根培養(yǎng)開放式試驗采用生根培養(yǎng)基MS+NAA 5.0mg/L+蔗糖30g/ L，次氯酸鈉濃度梯度設(shè)置為C1：800、C2：850、C3：900、C4：950、C5：1000、C6：1050、C7：1100、C8：1150、C9：1200mg/L，對照處理及接種方式與增殖培養(yǎng)次氯酸鈉濃度的篩選相同。從增殖培養(yǎng)無菌苗中選取長勢、數(shù)量等基本一致的瓶苗1200瓶，然后每個處理隨機選取40瓶進行試驗，3次重復。20d后觀察并記錄每瓶苗生根情況，并進行假植，約30d后分單株統(tǒng)計假植成活苗數(shù)，并計算平均每瓶所得苗數(shù)（不含污染瓶）。選取蔗苗生根率高且移栽成活率高的次氯酸鈉濃度為甘蔗開放組培生根培養(yǎng)的最佳濃度。

生根率=生根苗瓶數(shù)/接種總瓶數(shù)（不含污染瓶數(shù)）×100%。

1.3 試驗數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)收集整理采用Excel表，方差分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復極差法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的次氯酸鈉對培養(yǎng)基污染率的影響

不同處理濃度的次氯酸鈉對培養(yǎng)基污染率的影響見表1。由表1可見，在空白試驗中，培養(yǎng)基污染率隨著次氯酸鈉濃度的升高而降低，10mg/L濃度時培養(yǎng)基的污染率為85.83%，100mg/L濃度培養(yǎng)基污染率為15.00%，濃度在200mg/L以上時培養(yǎng)基的污染率為0；對上述未污染培養(yǎng)基接種常規(guī)無菌瓶苗再試驗，結(jié)果污染率也隨著次氯酸鈉濃度的升高而降低，其中10～100mg/L培養(yǎng)基污染率為100%，在200～600mg/L之間的污染率與傳統(tǒng)組培方式差異極顯著，在800～1000mg/L之間時培養(yǎng)基的污染率與傳統(tǒng)高溫高壓滅菌方式差異不顯著，次氯酸鈉濃度在1200mg/L以上對污染已可完全抑制，污染率為0。因此，次氯酸鈉可以作為甘蔗開放式培養(yǎng)的抑菌劑，以濃度在800～1200mg/L之間為宜。

2.2 增殖培養(yǎng)最佳次氯酸鈉濃度

在增殖培養(yǎng)基中添加不同濃度次氯酸鈉對甘蔗組培苗繁殖影響結(jié)果見表2。從表2可見，培養(yǎng)基污染率隨著次氯酸鈉濃度的升高而降低，其中，最高為B1達15.83%，最低為B8和BCK污染率均為4.17%，經(jīng)方差分析，BCK與B8、B9間差異不顯著，與其他處理達極顯著水平。在組培苗增殖方面，若考慮污染因素，即最終每瓶組培苗數(shù)以不污染瓶數(shù)進行平均，其增殖系數(shù)隨著次氯酸鈉濃度的升高而降低，其中增殖系數(shù)最大為對照，達2．34，其次為B1，為2．15，經(jīng)方差分析，差異達顯著水平；若不考慮污染因素，即以試驗初始苗數(shù)與最終組培苗數(shù)進行計算組培苗增殖率，結(jié)果增殖率出現(xiàn)先升后降的情況，其中，增殖率最高為BCK124．43%，其次為B3，為90．32%，增殖率從大到小依次為：BCK＞B3＞B5＞B4＞B2＞B1＞B7＞B6＞B8＞B9，經(jīng)方差分析，BCK與各處理均達極顯著水平，B3、B4、B5間差異不顯著。綜合污染率與成活率，增殖培養(yǎng)中次氯酸鈉處理濃度以900～1000mg/L為宜。

表1 添加不同濃度次氯酸鈉培養(yǎng)基污染情況

表2 培養(yǎng)基中添加不同濃度的次氯酸鈉蔗苗增殖情況

2.3 生根培養(yǎng)最佳次氯酸鈉濃度

在生根培養(yǎng)基中添加不同濃度次氯酸鈉對甘蔗組培苗生根影響結(jié)果見表3。從表3可見，培養(yǎng)基污染率隨著次氯酸鈉濃度的升高而降低，污染率最高為C1，達16．7%，最低為C9和CCK，均為4．2%，經(jīng)方差分析，CCK除與C8、C9差異不顯著外，與其他處理均達極顯著水平。在生根率方面，以瓶為單位統(tǒng)計，除去污染瓶外，其生根率為100%，從外觀看，加有次氯酸鈉的苗長勢略差于對照，主要表現(xiàn)在根的量相對少些、蔗苗不夠清秀等；處理生根苗假植成活率較高，均在93%以上，但各處理假植成活率高低與次氯酸鈉濃度的大小沒有規(guī)律性，其中最高為C3，達96．5%，最低C4，為93．2%；假植成活苗數(shù)隨著次氯酸鈉濃度的提高出現(xiàn)先升后降的情況，成活苗數(shù)最多為CCK，達4678株，最少為C1，為3354株，CCK與各處理間均達到極顯著水平，C1與C6差異達顯著水平，其他處理間差異不顯著。若把污染瓶去除后平均每瓶所得成活苗數(shù)，每瓶所得成活苗基本上隨次氯酸鈉濃度的增加而減少，但規(guī)律性不很明顯。其中CCK得苗最多，平均每瓶所得成活苗數(shù)為40．7株，其次是C6，為35．9株，最少為C9，只有30．5株。經(jīng)方差分析，CCK與C6差異達顯著水平，與其他處理間差異達極顯著水平；C6與C8、C9處理間差異達顯著水平，其他處理間差異不顯著。綜合污染率與成活率，生根培養(yǎng)中次氯酸鈉濃度以1000～1100mg/L為宜。

表3 培養(yǎng)基中添加不同濃度的次氯酸鈉蔗苗生根情況

3 討論

目前在植物開放式組培研究中，利用抗生、農(nóng)藥、家用消毒劑、植物提取物、食品添加劑等作為抑菌劑方面的研究均有報道。次氯酸鈉消毒劑是一種含有效氯和表面活性劑，能滲透各種有機物，對細菌、芽孢、病毒、結(jié)核桿菌增多有較強的殺滅作用，是一種高效消毒劑，在植物開放式組培中見有報道。王曉煌等[14]在煙草開放式組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的次氯酸鈉對煙草外植體誘導分化無明顯抑制作用，且能促進煙草外植體葉的分化；高濃度抑菌完全但外植體壞死率高，0．05%～0．01%次氯酸鈉抑菌效果良好，外植體成活率100%。解輝等[8]在巴西香蕉開放式組培研究中發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉作為香蕉開放式培養(yǎng)的抑菌劑，以濃度在0．01%～0．02%之間最好，增殖與生根培養(yǎng)選擇0．014%濃度最佳，在此濃度下香蕉增殖系數(shù)與生根率較高，分別為2．48%、83．0%。

本試驗結(jié)果，培養(yǎng)基中次氯酸鈉含量在800～1000mg/L之間時，培養(yǎng)基的污染率與傳統(tǒng)高溫高壓滅菌方式的污染率差異不顯著，次氯酸鈉濃度在1200mg/L以上對污染已可完全抑制，污染率為0；因此，次氯酸鈉可以作為甘蔗開放式培養(yǎng)的抑菌劑，以濃度在800～1200mg/L之間為宜。本試驗加入次氯酸鈉后，對甘蔗組培苗的增殖速度及生根均產(chǎn)生不同程度的影響，而且其影響程度隨次氯酸鈉濃度的提高而加重。雖然低濃度次氯酸鈉對組培苗生長影響程度相對較低，但其污染率較高，損失蔗苗較多，最后獲得的有效苗數(shù)不是最多；高濃度次氯酸鈉可有效抑制污染，但對組培苗生長影響程度較大，最后獲得的有效苗數(shù)也不是最多。在增殖培養(yǎng)方面，次氯酸鈉濃度900mg/L處理的增殖率最多，為90．32%，但低于對照的124．43%，其次是1000mg/L處理和950mg/L處理，增殖率也達88%以上；在生根培養(yǎng)方面，除去污染瓶外，各處理生根率均為100%，但從外觀看，加有次氯酸鈉的蔗苗根的量相對少些、蔗苗不夠清秀，最后生根苗假植獲得成活苗數(shù)最多的是1050mg/L，達3959株，其次是濃度1100mg/L處理，為3801株，均低于對照的4678株。因此，在一定濃度條件下，次氯酸鈉不僅可以抑制甘蔗組培過程中菌類的繁殖，而且對甘蔗組培苗繁育抑制作用不明顯，最宜濃度為900～1100mg/L。

抑菌劑加入培養(yǎng)基后，對菌類的繁衍有較好的抑制作用，但甘蔗組培苗的生長也受到一定程度的抑制和傷害，這與前人在其他植物的研究相似[8，16]。至于抑制和傷害等機理，有待進一步的研究。開放式組織培養(yǎng)技術(shù)由于對環(huán)境無嚴格的無菌要求，操作程序簡化，成本降低，是未來植物組織培養(yǎng)發(fā)展的主要方向。

[1]嚴華兵，閉志強，陳麗娟，等.香蕉組培工廠化育苗成本核算[J].中國南方果樹，2007，36（1）：30-32.

[2]李江，馬正炳，孫仲序，等.植物組織培養(yǎng)的簡化[J].植物生理學通訊，2003，39（4）：356-358.

[3]Yanagawa T，Tanaka R，F(xiàn)unai R.Simple micropropagation of ornamentals by direct application of chlorine disinfectants without equipment[J].Plant&Cell Physiology,2006,19(2):263-275.

[4]張慎，郭陶然，鄧志瑞，等．植物開放式組織培養(yǎng)的研究進展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（26）：14281-14283，14288．

[5]吳桂容，曲芬霞，余炳鋒．賀州荸薺開放式組織培養(yǎng)體系建立[J]．北方園藝，2013（6）：110-112．

[6]王趙玉，張健雄，戶新宇，等．抑菌劑在開放式植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J]北方園藝，2012（18）：125 127．

[7]黃泰達，莫廷輝.香蕉開放式組織培養(yǎng)中增殖培養(yǎng)基成分優(yōu)化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（18）：9584-9586．

[8]解輝，莫廷輝，曾麗星．次氯酸鈉在香蕉開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J]．熱帶作物學報，2011，32（5）：886-890．

[9]趙青華，陳永波，滕建勛，等．開放式組織培養(yǎng)下魔芋快繁技術(shù)研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（13）：114-115．

[10]趙青華，陳永波，楊朝柱，等．魔芋開放式組織培養(yǎng)技術(shù)初探[J]．氨基酸和生物資源，2009，31（4）：79-82．

[11]王丹，劉霞．山梨酸鉀在紅豆杉開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（2）：634-635．

[12]陳瑞丹，孫文薇．梅花品種“淡豐后”莖段開放式啟動培養(yǎng)的初步研究[J]．北京林業(yè)大學學報，2007，29（增1）：30-34．

[13]張薪薪，唐金花，王關(guān)林．抑菌劑在開放組培中的使用及效果研究[J]．遼寧師范大學學報：自然科學版，2005，28（4）：466-469．

[14]王曉煌，黃勝琴，李玲.4種抑菌劑在煙草開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學，2015（5）：0058-0062.

[15]李松，余坤興，劉麗敏，等.甘蔗莖尖胚狀體脫毒苗快繁技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39（2）：83-87.

[16]李曉燕.抑菌劑抑菌能力比較及其對組培苗生長發(fā)育的影響[D].大連：遼寧師范大學生命科學學院，2007.

Application Research of Sodium Hypochlorite in Open Tissue Culture of Sugarcane Rapid Propagation

LI Song,LIU Xin,LIU Hong-jiang,LIU Jun-xian,YU Kun-xing,LU Man-man,DAN Ming,LIU Li-min, HE Yi-bo,ZHANG Wei-zhen
(Sugarcane Research Institute,GXAAS/Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry,Nanning,Guangxi 530007)

Sugarcane ROC22 shoots,which was obtained from normal tissue culture,was used as subculture material to determine the effective concentration of sodium hypochlorite in open tissue culture and the optimal concentration at multiplication culture and rooting culture.The results showed that the concentration of sodium hypochlorite was effective for inhibition of medium pollution at more than 800 mg/L,better for proliferation rate at 900~1000 mg/L,and best for rooting at 1000~1100 mg/L.Conclusion:in sugarcane open culture,1000 mg/L hypochlorite was advisable.

sugarcane;sodium hypochlorite;open tissue culture

S566.1；Q81

A

1007－2624（2016）06－0003－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.06.002

2016-07-18

廣西自然科學基金項目“甘蔗開放式組織培養(yǎng)技術(shù)研究”（2014GXNSFAA118090）、廣西農(nóng)業(yè)科學院科技發(fā)展基金項目“甘蔗組織培養(yǎng)抑菌劑篩選研究”（2015JZ06）。

李松（1964-），男，廣西博白人，研究員，碩士，研究方向：甘蔗生物技術(shù)、誘變育種與栽培。E-mail：ls19009@163.com